メカニカルストレスによる歯根膜細胞のアポトーシス誘導に関する研究

2003 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 15592163
• Research Institution: Okayama University
• Principal Investigator: 坪井 佳子 岡山大学, 医学部・歯学部附属病院, 助手 (50325122)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 大矢 伸治 岡山大学, 医学部・歯学部附属病院, 医員 ; 宮本 学 岡山大学, 大学院・医歯学総合研究科, 助手 (40252978) ; 山本 照子 岡山大学, 大学院・医歯学総合研究科, 教授 (00127250)
• Keywords: メカニカルストレス / 歯根膜細胞 / アポトーシス / マクロアレイ法 / クローン

Research Abstract

矯正治療上、抜歯が必要と診断された患者に実験の趣旨を説明して同意を得た後、同歯の歯根膜を用いて、Flex bottom plateのシリコン膜上で細胞をアウトグロースさせた。これにより得られた歯根膜初代培養細胞に対し、持続的伸展力を、1時間、6時間、24時間負荷した後、酸性グアニジンフェノールクロロホルム法にて対照群、ストレス負荷群の総RNA約3μgを各々回収・精製した。これらを逆転写してcDNAを合成し、cDNAを^<32>pでラベルして、マクロアレイ法にて遺伝子発現の差を網羅的に検討した。遺伝子発現が最も大きく変化するのは、伸展力負荷後1時間であることがわかった。
マクロアレイ法により、ストレスに反応して発現の変動を認めた遺伝子として、細胞膜上蛋白や、アポトーシス誘導遺伝子、あるいは細胞周期調節遺伝子等が挙げられた。これらの遺伝子のうち数種類を選択しprimerを各々作製して、quantitative RT-PCRで定量的に遺伝子発現の差を調べ、マクロアレイ法で得られた結果が信頼できるものであることを確認した。
以上の実験は、再現性を確認するため、歯根膜提供者を変えて5種類行った。その結果、メカニカルストレスによる細胞膜上蛋白遺伝子の変動は、いずれも同様の傾向にあったが、それ以外の遺伝子発現に再現性を認めなかった。これは、ドナー間の差異、あるいは、多様な細胞集団という歯根膜の特性によるものと考えられた。
また、メカニカルストレスをかけた歯根膜の初代培養細胞にアポトーシスの実行が行われているかどうかを確認するため、DNA ladder detection法、TUNEL assayを行ったところ、アポトーシスの所見は認められなかった。
現在、以上の結果について、論文作成中であると同時に、メカニカルストレスによる細胞周期調節について検討中である。

Research Products

• [Publications] T.Fukunaga et al.: "Connective tissue growth factor mRNA expression pattern in cartilages is associated with their type I collagen expression."Bone. 33. 911-918 (2003)
• [Publications] H.Kamioka et al.: "Terminal differentiation of osteoblasts to osteocytes is accompanied by dramatic changes in the distribution of actin-binding proteins."J Bone Miner Res. 19. 471-478 (2004)