視覚的な微生物群集の検出・遺伝子発現・基質代謝解析に不可欠な細胞壁処理技術の開発

2003 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 15656126
• Research Institution: Nagaoka University of Technology
• Principal Investigator: 大橋 晶良 長岡技術科学大学, 工学部, 助教授 (70169035)
• Keywords: 細胞壁処理 / メタン生成古細菌 / CARD-FISH法 / 機能遺伝子mRNA / 高感度FISH法 / 視覚化

Research Abstract

高感度FISH法の一つであるCARD-FISH法をメタン生成古細菌に適用するための細胞壁処理方法について検討を行った。普遍的な細胞壁処理方法の確立を純菌を用いた検討から試みたが、非常に難しく、最終的にはメタン生成古細菌のもつ細胞壁を加水分解する酵素を用いて浸透性を向上させることで、CARD-FISH法の適用に成功した。しかしながら、酵素の特異性から、全てのメタン生成古細菌を網羅して、検出することはできなかった。一方で、従来のFISH法では検出が難しかったサンプルからのメタン生成古細菌の特異的検出に成功した。この事は、純菌で得られた知見が環境サンプルに対して適用可能であることを示唆している。また、検討した細胞壁処理方法の定量的解析への応用性も調べたが、これは純菌への検討結果が示唆した通り、検出率は従来のFISH法に比べて低くなるという結果が得られた(従来のFISH法で検出することが可能なサンプルに於いては)。CARD-FISH法のポテンシャルを把握するために、rRNAに比べて発現量が少ないmRNAの検出を試みた。若干実験操作が煩雑になり、時間を要するものの、純菌を用いた検討では、発現していると思われるmRNAの検出に成功した。これにより、微生物の持っている機能を基にした検出が可能になると考えられる。
このことから、CARD-FISH法を適用するための普遍的な細胞壁処理方法が確立されれば、微生物の解析に非常に有用なツールとなることが示唆された。今後、様々な方法を用いて、更に細胞壁処理方法の検討を行っていく予定である。

Research Products

• [Publications] 久保田健吾, 大橋晶良, 井町寛之, 原田秀樹: "メタン生成古細菌にCARD-FISH法を適用するための細胞壁処理"環境工学研究論文集. 40. 363-371 (2003)
• [Publications] Kubota, K., A.Ohashi, H.Imachi, H.Harada: "Fluorescence in situ hybridization combined with catalyzed reporter deposition for in situ analysis of metanogens in anaerobic digested sludge"Proceeding of IWA ASIAN WATERQUAL2003 (Oral presentation). 2Q6H0. 6-12 (2003)