FRETによるプロテオリシスのin situ可視化の試み

2003 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 15659047
• Research Institution: Kochi University
• Principal Investigator: 三井 真一 高知大学, 医学部, 助教授 (20295661)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 山口 希 京都府立医科大学, 医学部, 助教授 (40079752) ; 大迫 洋治 高知大学, 医学部, 助手 (40335922) ; 由利 和也 高知大学, 医学部, 教授 (10220534)
• Keywords: セリンプロテアーゼ / tissue plasminogen activator / plasminogen / FRET / プロテオリシス

Research Abstract

組織型プラスミノーゲンアクチベータ(tPA)をモデルにFRETによるプロテアーゼ活性の検出を行うこととした。tPAの基質であるマウス・プレプロプラスミノーゲンは812アミノ酸からなるが、581番目のアルギニンのC末側でtPAによる切断・活性化を受ける。この近辺の21アミノ酸をマウス肝由来cDNAよりPCRによって増幅してpEYFP-C1に挿入後、さらに、下流にECFPを挿入してpEYFP-PLG-ECFPを構築した。pEYFP-PLG-ECFPをHEK293細胞に一過的に発現させた細胞抽出液を得た。この抽出液中には抗GFP抗体に反応するおよそ60kDaの蛋白質がウェスタンブロットによって検出された。さらにこの抽出液について励起波長433nmでの蛍光スペクトルを測定すると、475nmに弱い蛍光と527nmに強い蛍光のピークを示し、EYFP-PLG-ECFP蛋白質によってECFPからEYFPへのFRETを測定することができた。しかしながら、この細胞粗抽出液37°で1時間以上インキュウベートするとセリンプロテアーゼ以外のプロテアーゼインヒビター存在下においてもEYFP-PLG-ECFPの分解が生じて蛍光が検出されなくなった。そこで、EYFP-PLG-ECFP蛋白質を精製することとして大量の蛋白質を調整するために、EYFP-PLG-ECFP発現細胞株の取得を試みた。HEK293にpEYFP-PLG-ECFPをトランスフェクトしてG418耐性細胞株をいくつかクローニングしたが、いずれの株も継代すると組み替え蛋白質の発現が見られなくなった。現在、EYFP-PLG-ECFPにHis-tagを導入して大腸菌による発現系を構築中である。