遺伝子治療のための染色体複製起点由来のエピソームベクターの開発に関する研究

2003 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 15659072
• Research Institution: Tokyo Metropolitan Organization for Medical Research
• Principal Investigator: 正井 久雄 財団法人東京都医学研究機構, 東京都臨床医学総合研究所, 副参事研究員 (40229349)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 林田 敏郎 財団法人東京都医学研究機構, 東京都臨床医学総合研究所, 研究員 (20342925) ; 須賀田 直子 財団法人東京都医学研究機構, 東京都臨床医学総合研究所, 主任研究員 (30344071)
• Keywords: エピゾームベクター / 遺伝子治療 / ORC / 複製起点 / 複製開始複合体 / MCM / EBウィルス / oriP

Research Abstract

遺伝子治療において、遺伝子導入に用いるベクターとしては、主に、ウィルスに由来したベクターが用いられているが、一長一短があり、種々の改良がなされている。一方、ウィルスに由来しない毒性の低い、自律複製能を有するエピソームベクターは、動物細胞ではまだ開発されていない。我々は、真核細胞の複製開始機構に基づいて、複製開始複合体を特定の配列にtargetすることにより、より効率良く複製複合体の構築をおこない、強い自律複製能を有するエピゾームベクターの開発を計画した。
この目的のために、本年度は、分裂酵母ORCのDNA結合ドメインであるORC4のDNA結合ドメインをヒトORC4のN端に融合した分裂酵母-ヒトキメラORC4(Sp-huORC4)を作製し、動物細胞内で発現した。さらにこのplasmid上に、分裂酵母ORC4の標的配列であるAT-rich複製起点配列を導入した。また、EBウィルスのEBNA1はoriP配列に特異的に結合するが、そのDNA結合ドメインをヒトORC4と融合し、EBNA1-huORC4キメラタンパク質も作製しつつある。これにより、oriP配列上に効率よく複製複合体が形成される可能性がある。
これらのplasmidを現在動物細胞に導入し、一過性に自立的に複製できるかどうかを検討している。もし一過性の複製が確認されたら、さらに、細胞内での安定な分配を保証する配列(EBウィルスのfamily of repreatsあるいはMAR配列)を導入し、動物細胞内で安定にepisomeとして維持されるvectorの開発をめざす予定である。

Research Products

• [Publications] Tanaka, T., Taniyama, C., Arai, K., Masai, H.: "ATPase/helicase motif mutants of Escherichia coli PriA protein essential for recombination-dependent DNA replication"Genes to Cells. 8. 251-261 (2003)
• [Publications] Sato, N., Sato, M., Nakayama, M., Saitoh, R., Arai, K., Masai, H.: "Cell cycle regulation of chromatin binding and nuclear localization of Cdc7-ASK kinase complex"Genes to Cells. 8. 451-463 (2003)
• [Publications] Kim, J.M., Takemoto, N., Arai K., Masai, H.: "Hypomorphic mutation in an essential cell-cycle kinase causes growth retardation and impaired spermatogenesis"EMBO Journal. 22. 5260-5272 (2003)
• [Publications] Mizukoshi, T., Tanaka, T., Arai, K., Kohda, D., Masai, H.: "A critical role of the 3'-terminus of nascent DNA chains in recognition of stalled replication forks."Journal of Biological Chemistry. 278. 42234-42239 (2003)
• [Publications] You, Z., Ishimi, Y., Mizuno, T., Sugasawa, K., Hanaoka, F., Masai, H.: "Thymine-rich single-stranded DNA sequences specifically activate mouse Mcm4/6/7 helicase on Y-fork and bubble-like substrates."EMBO Journal. 22. 6148-6160 (2003)
• [Publications] Furukohri, A., Sato, N., Masai, H., Arai, K., Sugino, A., Waga, S.: "Identification and characterization of a Xenopus homolog of dbf4, a regulatory subunit of the cdc7 protein kinase required for the initiation of DNA."Journal of Biological Chemistry (Tokyo). 134. 447-457 (2003)
• [Publications] 正井久雄: "DNAとそれを認識する蛋白質の多様性と普遍性 蛋白質 核酸 酵素 特集 DNA二重らせん構造の半世紀(1)"共立出版. 589-591 (2003)