ジーントラップ法を用いた蛋白合成制御とその異常による発がん機構の解明

2003 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 15659074
• Research Institution: Hiroshima University
• Principal Investigator: 信國 好俊 広島大学, 原爆放射線医科学研究所, 助教授 (80295641)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 石田 万里 広島大学, 原爆放射線医科学研究所, 助手 (30359898)
• Keywords: 蛋白合成制御 / ジフテリア毒素 / ジフタマイド / ジーントラップ / 挿入変異 / 遺伝子機能 / 挿入変異細胞ライブラリー / CHO細胞

Research Abstract

蛋白伸長因子eEF2のジフタマイド形成に重要な遺伝子群を単離同定し、細胞ストレスとジフタマイド形成ならびに蛋白合成制御機構とその異常によるヒト疾患(特に癌、腫瘍)発症機構を解明することを目的として研究を進めた。
まず、約100万の独立したジーントラップ挿入変異細胞からなる挿入変異CHO細胞ライブラリーから、ジフテリア毒素耐性変異細胞株72クローンを単離した。また、その中の高濃度のジフテリア毒素(2μg/ml)でセレクションを行い得られた24クローンはすべて緑膿菌外毒素Aに対しても耐性であることを確認した。緑膿菌外毒素Aとジフテリア毒素はいずれも蛋白伸長因子eEF-2のジフタマイド構造をADPリボシル化することで作用する。このことからこれらのジフテリア毒素耐性細胞の中には、ジーントラップ法でジスタマイド形成に必要な遺伝子が破壊され耐性となったものが多数含まれていると予想された。これまでの相補性解析の結果から、ジフタマイド形成に関与する遺伝子は複数個あると考えられている。
上記の高濃度のジフテリア毒素に耐性を示した24クローンにおいて、ジーントラップ法でトラップされた(同時に破壊された)遺伝子を5'-RACE法で増幅した後、塩基配列を解析することで同定を行った。そして、DTR-044と命名したクローンでは、ヒト卵巣癌の癌抑制遺伝子の一つとホモロジーのある遺伝子断片がトラップされており、これに対するマウス、ヒトの遺伝子ホモローグを変異細胞に発現させることで、変異細胞のジフテリア毒素感受性が回復することを確認した。
今後、ジフテリア毒素耐性変異株と遺伝子導入による復帰株の細胞増殖能、腫瘍形成能等を比較検討することで、単離同定した遺伝子機能とその疾患(癌、腫瘍)との関連性の解明を試みる。