2003 Fiscal Year Annual Research Report
GFPによるラットオピオイド受容体のリアルタイムでの可視化
Project/Area Number |
15659375
|
Research Institution | Kyoto Prefectural University of Medicine |
Principal Investigator |
溝部 俊樹 京都府立医科大学, 医学研究科, 講師 (50239266)
|
Keywords | ラット / オピオイド受容体 / GFP / リアルタイムイメージング / 脱感作 / desensitization |
Research Abstract |
rat opioid受容体とGFPとの融合遺伝子の作成 pGEMT-easy vectorに組み込まれたrat opioid receptor subtypes(μ,δ,κ)の3種のcDNA(京都大学麻酔科福田教授より提供)をホスト遺伝子として用いた。 1)コントロールの作成 提供されたプラズミドを鋳型にして、両端にそれぞれ、KpnI,XbaI siteを付属したプライマーを用いてPCRを行った。得られたPCR fragmentのdirect sequencingを行い、目的の断片が増幅していることを確認した。得られたPCR fragmentとpcDNA3 vectorを制限酵素KpnI/XbaIで消化し、両者をligationした。 2)opioid receptor-GFPの作成 1と同様の作業を、KpnI/NheI siteを使用して(opioid receptorのstop codonを消してKpnI siteを作りそのままGFP cDNAへと連結する)三種のopioid receptorをそれぞれpEGFPN-1 vectorに組み込んだ。 3)opioid receptor-GFPの機能確認 上記cDNAをDEAE dektran methodにてCOS cellにtransient transfectionし、細胞膜を回収した。 今年度中に、3H-bremazocinを用いて受容体結合試験を行い機能確認をする予定である。GFPとの癒合蛋白質が正常に機能すれば、予定通り来年度よりリガンド刺激による細胞膜内及び細胞内局在のリアルタイムでの観察を行う。
|