器官培養コルチ器へのprestin遺伝子(Pres)導入-prestinによる蝸牛増幅機構の直接的解析-

2003 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 15659400
• Research Institution: Hirosaki University
• Principal Investigator: 欠畑 誠治 弘前大学, 医学部附属病院, 講師 (90261619)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 和田 仁 東北大学, 大学院・工学研究科, 教授 (30111264)
• Keywords: prestin / 器官培養コルチ器 / 蝸牛外有毛細胞 / 蝸牛増幅機構 / キャパシタンス / パッチクランプ法

Research Abstract

目的:
prestinを発現させた培養コルチ器の挙動解析。
prestinの形質導入後の培養コルチ器の機能解析のためには、培養後48時間以上経過時に器官培養コルチ器より蝸牛外有毛細胞(OHC)、支持細胞(ダイテルス細胞)の単離・記録が確実に行えることが必要となる。そのためまず以下のごとき予備実験を行った。
方法:
1)コルチ器の器官培養:生後4-8日目のマウス(C57BL/6J)の蝸牛を用いて実験した。実体顕微鏡下に蝸牛を摘出し、骨組織、蝸牛軸、血管条を取り外し、頂回転側3分の1と、基底回転側3分の2とに切断し基底回転側を培養組織とした。
2)単離OHCのキャパシタンスの測定:器官培養コルチ器にtrypsin 1mg/mlを15分間反応させOHCの単離を行い、パッチクランプ法whole-cell modeにてキャパシタンスの測定をおこなった。
結果:
1)生後6、7日目のマウスより取り出した器官培養コルチ器からのOHCの単離、さらにはキャパシタンスの記録は、培養開始より3日目(72時間後)まで可能となった。
2)生後5-9日目のマウスから取り出したコルチ器にprestin遺伝子をリポフェクション法およびgene gunを用いて形質導入をおこなっている。GFP遺伝子を挿入することによりGFPの蛍光にてprestin遺伝子の導入を確認している。培養後48時間の時点で培養コルチ器よりOHC、支持細胞(ダイテルス細胞)を単離し、パッチクランプ法にてprestin遺伝子の発現を確認する予定である。