2004 Fiscal Year Annual Research Report
エチレンセンサーたんぱく質ETR1のシロイヌナズナによる発現系構築と構造解析
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15780080
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| Research Institution | The Institute of Physical and Chemical Research |
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Principal Investigator |
菊地 晶裕 独立行政法人理化学研究所, 城生体金属科学研究室, 研究員 (90321752)
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| Keywords | 情報伝達タンパク質 / エチレン / ETR1 / 膜タンパク質 / bioXAS |
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| Research Abstract |
植物ホルモンの中で最も単純な分子構造を持つエチレンは、植物の発生から枯死に至るまでの様々な過程において重要な役割を果たしている。しかし、植物のエチレン濃度感知機構や、その情報伝達機構に関しては不明な点が多く残されている。本研究では、シロイヌナズナ由来のエチレンセンサータンパク質ETR1におけるエチレン感知とその情報伝達機構を解明することを目的として、ETR1の大量発現系構築を行った。
平成16度は、シロイヌナズナの培養細胞T87を用いた発現系構築を行い、5系統の形質転換した培養細胞を得ることができた。得られた細胞の膜画分を用いてウェスタンプロットを行ったところ、ETR1の強発現を2系統で確認できた。1度の培養で得られるETR1は微量(ナノグラムオーダー)であり、より高発現を目指して培養条件の検討を行なったが、飛躍的な向上には至っていない。
微量ではあるが、発現したETR1のHis-tagアフィニティカラムによる精製条件の検討も行った。ETR1は膜タンパク質であり、界面活性剤での可溶化が必要となるが、用いる界面活性剤によってはアフィニティカラムに非特異的に吸着してしまった。しかし、最適な界面活性剤を選択することができれば、精製も可能であると思われる。
ETR1は銅イオンを含むので、本研究では精製後にX線吸収スペクトル(XAS)の測定を行う計画であった。しかし、本研究のように微量の試料しか得られない場合、従来の測定システムでの測定は困難である。そこで、平成16年度には微量XAS測定に向けた実験もSPring-8で行なった。その結果、本研究の対象試料ではないが、Rieske-type [2Fe-2S]型クラスターを有する金属タンパク質の微量XAS測定から、鉄イオンの配位数を決定することに成功し、その結果を論文として発表することができた。
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