2003 Fiscal Year Annual Research Report
ルーメン細菌の効率的な検出のためのマルチプレックスPCR法の確立
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15780177
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| Research Institution | National Agricultural Research Organization |
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Principal Investigator |
田島 清 独立行政法人農業・生物系特定産業技術研究機構, 畜産草地研究所・家畜生理栄養部, 主任研究官 (80343953)
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| Keywords | ルーメン細菌 / マルチプレックスPCR |
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| Research Abstract |
ルーメン細菌の生態研究を効率的に行うために、細菌構成を簡便に調べる方法の確立が求められている。PCRによるルーメン細菌の検出は、迅速に細菌構成を調べる1つの方法である。既に繊維分解菌などのルーメンに生息する主要菌種を検出するプライマーが報告されているが、さらに検出できる菌種を増やし、マルチプレックスPCRによる検出の効率化を試みた。
ルーメンに生息する23菌種を標的菌種とした。PCRによる検出法が報告されている14菌種についてはそのプライマーを用い、新たに9菌種に対してプライマーを作製した。BLASTにより標的菌種に特異的であることを確認し、次いで菌株由来またはルーメン内容物由来のDNAを用いて増幅の有無とサイズの確認を行った。次いで作製したプライマーを用いて、マルチプレックスPCRの条件検討を行った。PCR反応時のアニールの温度、増幅サイズにより同時に検出する菌種を選定した。マルチプレックスPCRにはQIAGEN Multiplex PCR Kitを用い、推奨される反応条件をもとに各菌種検出のための至適化を行った。
作製したプライマーは標的とする菌株のDNAからのみ目的のサイズでの増幅を示した。また、ルーメン内容物から採取したDNAを用いた単一のプライマーによる検出では、23菌種中17菌種の検出が可能だった。23菌種のうち17菌種を選び、1反応あたり34菌種(5反応で17菌種)についてマルチプレックスPCRによる検出を行った。各菌株から抽出したDNA混合液を用いたマルチプレックスPCRによる検出では標的菌種を全て検出することができ、ルーメン内容物由来のDNAを用いた場合には13菌種の検出が可能だった。
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