2003 Fiscal Year Annual Research Report
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15790024
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
野口 修治 東京大学, 大学院・薬学系研究科, 助手 (60237823)
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| Keywords | タンパク質翻訳後修飾 / アスパラギン異性化 / アスパラギン酸異性化 / イソアスパラギン酸 / 異性化タンパク質 |
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| Research Abstract |
ヒト由来イソアスパラギン酸メチル基転移酵素(hPIMT)のcDNAをヒト脳cDNAライブラリーよりPCR法により増幅して得た。得られたcDNAの塩基配列を決定したところ、227アミノ酸残基(分子量24636.3)からなり119番目にVal残基、205番目にLys残基をもつアイソザイムであることが明らかになった。このcDNAをpETベクターに組み込み、大腸菌に導入して発現の様子を調査したところ、hPIMTと考えられる分子量約25kDaのタンパク質の発現が確認できた。しかし、そのタンパク質のほとんどは大腸菌破砕液の沈殿画分に含まれていた。hPIMTには活性に関与しない複数のシステイン残基が容易に酸化されてしまう傾向があり、そのことが大腸菌内で沈殿を形成してしまう原因と考えられた。そこで当該システイン残基をチオール基を含まない別のアミノ酸残基に置換した変異体hPIMTの塩基配列を設計し、そのcDNAをPCR法により合成した。また、タンパク質の立体構造において一定のコンフォメーションを形成していないポリペプチド鎖部分は一般に結晶化を阻害するので、hPIMTにおいて一定のコンフォメーションを形成していないと考えられる部位を除去した変異体hPIMTの塩基配列も設計し、cDNAをPCR法により合成した。両変異体タンパク質の発現系を作成して発現の様子を調べたところ、どちらの変異体タンパク質も大腸菌破砕液の可溶性画分に含まれていた。この発現系を用いてhPIMT変異体タンパク質の精製方法を確立して結晶化をすすめ、X線構造解析を行う予定である。
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