C型肝災ウイルス(HCV)複製モデルを用いたHCV増殖に伴う肝発癌機序の解明

2003 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 15790350
• Research Institution: Ehime University
• Principal Investigator: 日浅 陽一 愛媛大学, 医学部附属病院, 助手 (70314961)
• Keywords: C型肝炎ウイルス / T7ポリメラーゼ / アデノウイルスベクター / RPA / real-time RT-PCR

Research Abstract

感染性を有するC型肝炎(HCV)の全長クローンから作成されたcDNAの5'側にT7プロモーターを、3'側にデルタ肝炎ウイルスのリボザイム遺伝子を持つプラスミド(pH77)を作成した。これをCV-1細胞あるいはHuh7細胞にトランスフェクションし、さらにT7ポリメラーゼを発現する組換えアデノウイルス(Ad-T7)を感染させることによりHCV遺伝子を宿主細胞に発現させHCV replication systemの開発を試みた。感染後1,2,3,5,7,9日でRNAおよび蛋白を回収した。HCV negative鎖の発現はRPA法およびreal-time RT-PCRにて感染後9日まで持続的に検出可能でありHCV replicationが確認された。またHCVコア蛋白もWestern BlottingおよびELISA法にて発現後9日まで持続的に検出可能であった。その間細胞障害はほとんどみられず、細胞毒性の少ない、長期間HCV full-genomeを発現するreplication systemの開発に成功した。Real-time RT-PCR法、ELISA 法において、HCV positive鎖、negative鎖、HCV コア蛋白は発現後3日ピークが持続し、以後漸減した。
さらに、アデノウイルスベクターを用いず、より細胞毒性の少ない系として、T7 polymeraseを持続発現する細胞株(Huh-T7)を用いてHCV長期発現系を樹立した。この系においても発現後9日までHCV negative鎖、HCVコア蛋白の検出が可能であり細胞障害はみられなかった。
今後このHCV full-genome replication systemを用いて抗ウイルス薬であるインターフェロンなど薬剤のHCV複製に及ぼす影響や、HCV複製とPKRとの相互関係についてさらに解析していく予定である。

Research Products

• [Publications] Hiasa Y, Kamegaya Y, Nuriya H, Onji M, Kohara M, Schmidt EV, Chung RT.: "Protein kinase R is increased and is functional in hepatitis C virus-related hepatocellular carcinoma."American Journal of Gastroenterology. 98. 2528-2534 (2003)