前立腺癌におけるアンドロゲン受容体の動態・構造解析

2003 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 15790848
• Research Institution: Kanazawa University
• Principal Investigator: 今尾 哲也 金沢大学, 医学部附属病院, 助手 (70345619)
• Keywords: 前立腺癌 / androgen receptor / Green Fluorescent Ptotein

Research Abstract

Green Fluorescent Protein (GFP)融合androgen receptor(AR)発現plasmidの作成。
ARの細胞内での動態を可視化するために、細胞に蛍光をあてると発色するタンパク質をARに融合させるために分子生物学的手法を用いてplasmidを作成した。
この際、ARはN末から40アミノ酸(Smal site)が欠失したもの(3kb)、約300アミノ酸(Nrul)が欠失したもの(2kb)をpEGFP-Cl(クロンテック)ベクターに挿入し、EGFP蛋白のC末にARがつながる融合タンパク質を発現するようにした。この2種のAR発現ベクターはDNA binding domain, Ligand binding domainを持っているため、これを用いてまず、ARの活性の有無をPSA promoter + luciferase reporterとともにARの発現していない前立腺癌細胞PC-3にtransfectし、luciferase assayをおこなった。しかし、DHTを加えてもほとんど活性が認められなかった。遺伝子配列には間違いがなかったため、N末の欠失をなくし、完全長のAR(3.1kb)をEGFP蛋白のC末につなげるように工夫をし、pEGFP-hARベクターを作成した。これを用いてreporterとともにtransfectし、luciferase assayを行うと、DHTにより明らかな活性の上昇を認めた。つまり、N末40アミノ酸にARの活性を調節する領域があることが判明した。