アデノウイルスE1a遺伝子を利用した口腔癌に対する新治療法開発

2003 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 15791053
• Research Institution: Osaka Dental University
• Principal Investigator: 富永 和也 大阪歯科大学, 歯学部, 助手 (80278572)
• Keywords: 癌新治療法 / TAT-protein / E1A

Research Abstract

・SF DowdyとMaterial Transfer Agreementを交わし、日本でのtat-e1aプラスミドおよびTAT-E1A proteinの使用許可を得た。
・Tat-e1aプラスミド含有E.coliから、TAT-E1A proteinを10回pulificationし、Laemmli試料溶液に溶解させ、12.5%ゲルを支持体としたトリス-グリシン系SDS-PAGEを行い、CBB染色を施し泳動パターンを観察したところ、9回分の産物から目的となる分子量をもった単一バンドを得た。なお、これら9回分の産物はそれぞれ約1mLずつ得られている。
・L GuelenらがTAT-proteinを用いた実験を発表(Oncogene23(5),1153-1165,2004)しており,その中で使用されたTAT-GFPが本研究でも有用なコントロールとなりうるので,tat-gfpプラスミド含有E.coliを譲渡してもらった。現在、TAT-GFP proteinをpulification中である。
・癌細胞株SCCVIIは、RPMI-1640で培養したが、FBSは14%濃度必要であった。SCCVIIのgrowth curveを描き、PDTを計算したところ、0.83日であった。現在、in vivo workに備え、大量培養が済み、凍結保存状態にある。
・本in vivo実験は、SCAW分類・カテゴリーDに相当するので、動物実験計画書を作製、実験許可を申請中であり、現在、実験許可(承認)を待っている。
・今後行う予定であるWestern blotting、免疫組織化学的染色に備え、抗E1A抗体を用いてDot blottingを行った。ECLによる抗原濃度は、約0.1μg/mLが検出限界であることが判明した。