ビジュアルスクリーニング法を用いた耳下腺細胞の新規シグナル分子の検索と機能解析

2003 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 15791066
• Research Institution: Health Sciences University of Hokkaido
• Principal Investigator: 森田 貴雄 北海道医療大学, 歯学部・歯科薬理学講座, 助手 (20326549)
• Keywords: GFP / 耳下腺腺房細胞 / IP_3受容体 / 細胞内局在 / 可視化 / Ca^<2+>流入

Research Abstract

耳下腺腺房細胞における水・電解質分泌やタンパク質の開口分泌はCa^<2+>、PKC、PKAなどで調節されるが、その下流の情報伝達機構や転写調節機構は明らかにされていない。本研究は、耳下腺腺房細胞の情報伝達や転写制御に関与する分子群を明らかにすることを目的とする。耳下腺腺房細胞から得られたcDNAをGFP融合タンパク質として発現させたGFP標識ライブラリーを用い、細胞内小器官や細胞膜に局在するタンパク質や細胞骨格タンパク質を網羅的に検索することを試みた。
ラット耳下腺腺房細胞から抽出したmRNAをもとにcDNAを合成し、これをGFPベクターに組み込んだGFP標識耳下腺cDNAライブラリーを作成した。ライブラリー遺伝子をヒト唾液腺由来腫瘍細胞(HSY細胞)に導入し、GFP融合タンパク質を定常的に発現する細胞株を作製したGFP融合タンパク質の細胞内分布を共焦点レーザー顕微鏡でモニターし、その特異的な局在を示す細胞株を選択した。現在27種の細胞株を得ており、これらの細胞からRNAを単離した。
また、GFP融合タンパク質の機能を解析するためのモデル分子として、GFP-IP_3R3融合タンパクを用いた。GFP-IP_3R3をIP_3R欠損変異細胞(DT40-IP_3RKO)に発現させ、Ca^<2+>反応を解析したところ、 GFP-IP_3R3はIP_3依存性Ca^<2+>チャネルとして機能することが確かめられたB cell receptor(BCR)を活性化すると、GFP-IP_3R3発現細胞では細胞外からのCa^<2+>流入が認められた。この流入は容量性Ca^<2+>流入を阻害するLa^<3+>存在下でもブロックされないことから、BCR介在性Ca^<2+>流入と、容量性Ca^<2+>流入はそのメカニズムを異にすることが示唆された。さらに、BCR介在性Ca^<2+>流入はIP_3R欠損細胞では起こらないことから、IP_3Rを必要とすることが示唆された。