2004 Fiscal Year Annual Research Report
ビジュアルスクリーニング法を用いた耳下腺細胞の新規シグナル分子の検索と機能解析
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15791066
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| Research Institution | Health Sciences University of Hokkaido |
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Principal Investigator |
森田 貴雄 北海道医療大学, 歯学部歯科薬理学講座, 助手 (20326549)
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| Keywords | GFP / 耳下腺腺房細胞 / IP_3受容体 / 細胞内局在 / 可視化 / Ca^<2+>流入 |
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| Research Abstract |
耳下腺腺房細胞における水・電解質分泌やタンパク質の開口分泌はCa^<2+>、PKC、PKAなどで調節されるが、その下流の情報伝達機構や転写調節機構は明らかにされていない。本研究は、耳下腺腺房細胞の情報伝達や転写制御に関与する分子群を明らかにすることを目的とする。
ラット耳下腺由来cDNAライブラリーに含まれる遺伝子をGFP融合タンパク質として発現させ、それらの局在を指標にして未知のタンパク質を検索するVisual Screeningの開発を試みた。いくつかのスクリーニング法を試行し、その効率を比較検討したところ、定常発現法より一過性発現法によるスクリーニングが効率的であると考えられた。特異的局在を示し、frameが合う形でGFPと融合タンパク質をつくるものは30クローン中1クローンであった事から、30クローンを1プールとして細胞に一過性に発現させ、目的の発現パターンを示すプールからクローニングする方法が最も効率的であると考えられた。現在30クローンをプールとしたスクリーニングを進めており、これらの中に細胞骨格や細胞膜などに発現するGFP融合タンパク質が観察された。
GFP融合タンパク質の機能解析のモデルとして、GFP-IP_3R3融合タンパクをIP_3R欠損変異細胞(DT40-IP_3RKO)に発現させ、Ca^<2+>反応を解析した。GFP-IP_3R3はIP_3依存性Ca^<2+>チャネルとして機能し、内在性type3 IP_3Rと同様なチャネル特性を持っていることが確認された。GFP-IP_3R3発現細胞ではBCR活性化により細胞外からのCa^<2+>およびBa^<2+>の流入が認められ、La^<3+>存在下でもブロックされなかった。さらにBCR介在性Ca^<2+>流入はIP_3Rを必要とすることが示唆され、これらのことからBCR介在性Ca^<2+>流入と容量性Ca^<2+>流入はそのメカニズムを異にすることが示唆された。
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