2016 Fiscal Year Annual Research Report
ランダム変異導入によるセルロース合成酵素の構造・機能相関解析
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15F15092
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
杉山 淳司 京都大学, 生存圏研究所, 教授 (40183842)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
PENTTILAE PAAVO 京都大学, 生存圏研究所, 外国人特別研究員
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| Project Period (FY) |
2015-10-09 – 2018-03-31
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| Keywords | セルロース合成酵素 / バクテリアセルロース / ヘミセルロース / 小角散乱 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
セルロースは複数本の分子鎖が束ねられたミクロフィブリルとして存在する。セルロース合成酵素は、糖転移反応によるグルコースの重合と、合成された高分子セルロース鎖をミクロフィブリル構造にまとめる構造制御の2つの過程を含む。この２段階過程を精査するために、以下の実験に取り組んだ。
重合過程については、組換え体セルロース合成酵素によるセルロース大腸菌合成系を使い、セルロース合成酵素の構造・機能相関分析や、試験管内合成反応系得られる人造セルロースの構造解析を行った。
構造制御過程については、モデル生物である酢酸菌を用いて検討を進めた。ヘミセルロースの共存化でセルロース成させることにより、様々なセルロース・ヘミセルロース複合体を調製し、その形成過程ならびに酵素分解過程を精査することにより、セルロース分子の集合あるいは分解過程におけるヘミセルロースの影響を明らかにした。
以上の方針に沿って、研究成果を３編の論文にまとめている。また継続中の課題についてはさらに引き続き研究を進め、追加実験等を追加することにより最終的位に論文に取りまとめる予定である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
植物細胞壁を模倣した複合材料については、バクテリアセルロースを木材由来のヘミセルロース存在下で静置培養することにより作成した。針葉樹材スプルース（マツ科トウヒ属）由来のガラクトグルコマンナンと広葉樹材ブナ（ブナ科ブナ属）由来のキシランを添加物に加えた場合のバクテリアセルロースのモルフォロジーについて、高分解能放射光X線小角散乱により精査した。小角散乱強度プロフィールのフィッティングには様々なレベルの階層状の構造を仮定することが不可欠であった（複雑さの証明でもあると考える）。これらの現象については、未乾燥の水分を多く含む場合と乾燥後で比較を行い、階層状構造の高次側の構造に大きな変化があることを証明したのを始め、乾燥後のサンプルについては走査型電子顕微鏡、透過型電子顕微鏡、さらには赤外線吸収スペクトロスコピーなどを用いてその固体構造を解析した。特筆すべき点としては、ヘミセルロースが存在することにより、バクテリアセルロースのIα成分が減少することと、セルロースミクロフィブリルの断面の大きさが減少することが示された。このことは、ヘミセルロースがセルロースミクロフィブリルの構造形成、特にフィブリル束に成長する際の充填様式に影響することを示すものである。このヘミセルロースによるいわばミクロフィブリルの形成制御はガラクトマンナンよりもキシランにおいて顕著であるとともに、いずれの場合もヘミセルロースの濃度が高まるにつれて及ぼす影響も大きいことが示唆された。
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| Strategy for Future Research Activity |
リグノセルロースから燃料やバイオケミカルスを生産するにあたって、酵素分解効率は極めて重要な因子である。特にバイオマスにおいてはその高次構造（リグニン、ヘミセルロースによって被覆されたセルロースミクロフィブリル）がボトルネックであり、その界面を制御して酵素にセルロース表面を暴露することによって、飛躍的な酵素糖化性能の向上が期待出来る。そのモデル実験として、ヘミセルロース存在下で合成したバクテリアセルロースを調べたところ、キシランの吸着したセルロースに比べ、ガラクトマンナンに被覆されたセルロースは酵素糖化を受けにくいことを見出した。またその高分解能放射光X線小角散乱による検討から、ナノスケールの構造変化があることがわかった。
このように、ヘミセルロース共存下で合成したバクテリアセルロースを市販酵素により酵素分解を行い、その加水分解挙動の変化を広角回折と小角散乱の時系列測定（高輝度放射光実験施設Spring-8の2015B公募課題）により行った。同時に重水素化したサンプルを調製して中性子線小角散乱J-PARCの実験計画を立てたが、残念なことに２度とも課題が受理されなかった。結果的には、報告者の次の受け入れ先（Institut Laue-Langevin グルノーブルにある中性子実験施設）において、本実験を継続検討する予定である。これらの実験を通して、ヘミセルロースによるセルロース表面の被覆や酵素糖化率のヘミセルロース依存性などを明らかにする予定である。
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