2016 Fiscal Year Annual Research Report
運動・ストレス・老化に関する新規バイオマーカーの開発と機能解析
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15H01833
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| Research Institution | Waseda University |
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Principal Investigator |
鈴木 克彦 早稲田大学, スポーツ科学学術院, 教授 (80344597)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
秋本 崇之 早稲田大学, スポーツ科学学術院, 教授 (00323460)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | 運動 / 老化 / マウス / 共発現遺伝子ネットワーク / 翻訳 / 細胞 / マイクロRNA / 機能解析 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
今年度は、持久性運動と老化マウスモデルに転写・翻訳動態の網羅的解析を適用し、さらに共発現遺伝子ネットワーク解析（WGCNA）を行うことで、共発現している遺伝子を探索し、共発現遺伝子ネットワークを構築した。
WGCNAの一つの特徴として、同一の共発現ネットワーク内の遺伝子群は似たような機能を有していることが多い。そのため、機能が未知であった遺伝子も近傍の既知遺伝子の機能から機能未知遺伝子のはたらきを推測することができる。WGCNAの結果、転写動態ではみられない、翻訳動態特異的なネットワークを発見した。そのうちの一つは、リボソーム複合体や翻訳に関わる遺伝子が多く含まれており、これまで翻訳とは全く関係性が認められていない遺伝子も存在していた（遺伝子群ｘ）。前述の通り、WGCNAでは類似した機能を有する遺伝子が同一ネットワークに集まる傾向が強いため、これら遺伝子群ｘは翻訳を調節している新しい因子である可能性が示唆された。
遺伝子群ｘの翻訳に関する機能を実験的に検証するために、これらの遺伝子を培養細胞においてノックダウンさせ、遺伝子群ｘの細胞増殖と翻訳動態への影響を検証した。その結果、遺伝子群ｘの発現量低下により、細胞の増殖が著しく停滞し、細胞内のタンパク質産生量も顕著に減少した。このことから、遺伝子群ｘは新規翻訳調節因子である可能性が示唆された。
また、老化とトレーニング効果に関与するマイクロRNA（miRNA）に関しては、高齢マウスおよびトレーニングされたマウスを対象に、miRNA発現の網羅的解析およびmiRNAが標的とすると考えられるmRNA発現の網羅的解析を実施し、老化・トレーニングとの関連が認められたmiRNAを複数同定した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
今年度は持久性運動と老化マウスモデルから得られた骨格筋サンプルに転写・翻訳動態の網羅的解析を適応し、共発現遺伝子ネットワーク解析（WGCNA）を行うことで、翻訳動態特異的なネットワークおよび翻訳調節に寄与する新しい遺伝子（遺伝子ｘ）を発見した。現在はどのように遺伝子群ｘが翻訳を調節しているのかを実験的に検証しようとしている。また、老化マウスおよびそのトレーニングのサンプルの解析によって加齢やトレーニングとの関連が認められたmiRNAを複数同定することができたので、今後はそれらのmiRNAがどのような機能をもつかについて解析を進める。以上のように、網羅的解析から運動・老化・トレーニングに関連する分子がリストアップされ、それらの分子の機能解析が進められつつあり、おおむね順調に進展していると言える。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後は今年度発見された遺伝子が実際に翻訳調節に寄与しているのかを検討し、さらにその作用機序も解明する。
遺伝子ｘの翻訳に関する機能を実験的に検証するために、これらの遺伝子を培養細胞においてノックダウンさせ、遺伝子ｘの細胞増殖と翻訳動態への影響を検証する。細胞増殖に関しては、発光プレートリーダーを用いて細胞数に比例する細胞内ATPを測定することで検証できると考えられる。翻訳動態に関しては、翻訳伸長阻害剤であるピューロマイシンを用いる。ピューロマイシンは産生中のペプチドに取り込まれるため、抗ピューロマイシン抗体により産生中のタンパク質を定量することができると考えられる。
遺伝子ｘが新規翻訳調節因子であった場合は、その作用機序の解明も試みる予定である。具体的には、共免疫沈降法（Co-IP）で得られる遺伝子ｘと相互作用するタンパク質複合体を、質量分析法（MS）によって同定する。さらに、MSにより得られた候補タンパク質の相互作用を、Co-IP精製物をウェスタンブロットにより確認することにより、遺伝子ｘがどのような作用機序により翻訳を調節しているのかを検討することができると考えられる。
また、今年度、老化とトレーニングの関連が認められたmiRNAについては、その機能を解析するため、骨格筋細胞にて当該miRNAを操作し、その表現型を検討する予定である。遺伝子・タンパク質の発現はリアルタイムPCR、ウェスタンブロット法、免疫組織染色法等にて評価し、細胞機能と細胞内外の情報伝達経路の連動について機序究明を目指す。
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