2015 Fiscal Year Annual Research Report
高速人工抗体創製法 の開発とタンパク質 １分子単位定量への 応用
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15H02006
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| Research Institution | Nagoya University |
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Principal Investigator |
村上 裕 名古屋大学, 工学(系)研究科(研究院), 教授 (10361669)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
矢島 潤一郎 東京大学, 総合文化研究科, 准教授 (00453499)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | 抗体 / １分子 / 血管内皮細胞増殖因子受容体 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
標的タンパク質に高親和かつ特異的に結合する人工抗体を得るためには、人工抗体の骨格の選択と人工抗体ライブラリ遺伝子の質が大切である。本研究では、人工抗体の骨格として多くの実績があり小型である2種類のタンパク質を使用した。まず、ヒトのフィブロネクチンの1ドメイン（10FN3：90残基程度）の3つのループ部分の遺伝子を様々な長さのランダム配列に置き換えた遺伝子を作製した。また別に、ラマ一本鎖抗体の抗原認識ドメイン（sAb：120残基程度）の3つのループ部分の遺伝子を様々な長さのランダム配列に置き換えた遺伝子も作製した。これらの遺伝子の質を担保するために、それぞれ217遺伝子と215遺伝子についてDNA配列解析を行い、約60%の遺伝子が人工抗体ライブラリとして使用可能な遺伝子であることが分かった。また、ループ配列も完全にランダム化されており、進捗状況でも述べたように10兆種類のライブラリの多様性も確保できていることから、作製したライブラリは質の高いものであると考えられる。次に、我々が以前にペプチド選択法に開発したTRAP提示法を改良して、高速人工抗体創製法の開発を試みた。様々な条件を最適化し、人工抗体のN末端を改良することで、人工抗体を効率よく提示する方法を確立した。さらに、本方法を用いて血管内皮細胞増殖因子受容体2に対して結合する人工抗体の選択操作を行い、血管内皮細胞増殖因子受容体2に結合するフィブロネクチンの1ドメインとラマ一本鎖抗体の遺伝子ライブラリを得ることに成功した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
まず、ヒトのフィブロネクチンの1ドメインとラマ一本鎖抗体の抗原認識ドメインの3つのループ部分の遺伝子を、様々な長さのランダム配列に置き換えた遺伝子を作製した。通常、この大きさの遺伝子の合成には外部委託遺伝子合成サービスを利用するが、本研究では10兆種類以上のランダム配列を持つ人工抗体遺伝子が必要であることから、ランダム配列を持つ合成オリゴヌクレオチドを、多様性を保つように設計された方法によって組み合わせて、人工抗体遺伝子ライブラリ遺伝子を作製した。こうして作製した遺伝子を、これらの遺伝子の質を担保するために、それぞれ217遺伝子と215遺伝子についてDNA配列解析を行ったところ、フィブロネクチンについては124遺伝子、ラマ一本鎖抗体についても124遺伝子の遺伝子について、正しい骨格の塩基配列を保持していることが分かった。60%の遺伝子が正しい配列を持つことから本遺伝子はライブラリ遺伝子として十分に質の高いものであるといえる。また、ループ部分の配列は完全にランダム（NNKコドン）であり、遺伝子のライブラリ化が成されていることが確認できた。次に、我々が以前に開発したTRAP提示法を、人工抗体を提示するように最適化して高速人工抗体創製法を確立した。翻訳時の翻訳に関わる因子の濃度や、人工抗体自身のN末端の配列を最適化することで、効率よく人工抗体を提示することが可能となった。こうして開発した高速人工抗体創製法を用い、計画を前倒しして、血管内皮細胞増殖因子受容体2に対して結合する人工抗体の選択を試みた。その結果、ヒトのフィブロネクチンの1ドメインと、ラマ一本鎖抗体の抗原認識ドメインを骨格としたライブラリから、標的に結合活性を持つ人工抗体の遺伝子ライブラリの濃縮に成功した。
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| Strategy for Future Research Activity |
本年度の研究により、ヒトのフィブロネクチンの1ドメインとラマ一本鎖抗体の抗原認識ドメインの3つのループ部分の遺伝子を様々な長さのランダム配列に置き換えた遺伝子を作製した。またこれらライブラリをmRNA上に効率よく提示する方法を確立し、それぞれのライブラリから、モデルタンパク質標的である血管内皮細胞増殖因子受容体2に対して結合活性を持つ人工抗体の遺伝子ライブラリを濃縮した。ただし、遺伝子の濃縮を進める間に、ライブラリ遺伝子が短くなることがわかった。これは逆転写やもしくはPCRを行う際にループに導入したランダムな遺伝子の配列にプライマーがミスアニールして生成したものと考えられる。来年度は、まず反応条件、プライマーの配列、選択方法を最適化することで、短い遺伝子の生成を抑制することを試みる。また、本年度に濃縮した血管内皮細胞増殖因子受容体2に対して結合活性を持つ人工抗体の遺伝子ライブラリを解析して、さらに人工抗体を大腸菌で発現・生成し、血管内皮細胞増殖因子受容体2に対する結合特性を評価する。これにより、その後のモデル実験に最適な人工抗体を選ぶ。次に、この人工抗体を大量に調製して蛍光色素で標識し一分子観察を行う。我々は、蛍光色素のタンパク質への修飾により、タンパク質が沈殿しやすくなる、またはタンパク質の非特異的な吸着特性が増大すると考えている。そのため、化学修飾やSNAP-Tagなど様々な方法を試し、この標識化法の最適化を行う予定である。また一分子観察においては、標識する蛍光色素の数も重要になることから、できるだけ標識の位置や数が制御できる方法を検討する計画である。こうして作製した蛍光標識VEGFR2人工抗体を用いて、タンパク質１分子定量のモデル実験を行う。
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