生活習慣病に強相関する核酸メチル化の超高感度検出化学技術開発

2016 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 15H02190
• Research Institution: The University of Tokyo
• Principal Investigator: 岡本 晃充 東京大学, 先端科学技術研究センター, 教授 (60314233)
• Project Period (FY): 2015-04-01 – 2018-03-31
• Keywords: エピジェネティクス / ＤＮＡメチル化 / 金属錯体 / ＲＮＡ修飾

Outline of Annual Research Achievements

生活習慣病に強相関する核酸メチル化を化学的手法で検出することを目指した。その達成には、超高感度であること、配列選択的であること、高効率であることなどが必要であり、そのためにオリジナルな化学プローブをオリジナルな化学反応をベースにして創出して、その高感度化を図ることによって生活習慣病をメチル基レベルで可視化する臨床応用可能な技術を包括的に開発するための研究を展開した。概要は次の通り。
1． 腫瘍不均一性を解くためのDNA 反復配列に現れるメチル化の超高輝度検出：L-DNAを基本骨格としたLT-FISH法を開拓して、細胞内のわずかな核酸ターゲットをハイブリダーゼ―ションにより標識して可視化できる方法を得た。シングルローカスメチル化を検出するための機能を得た。
2． 腫瘍術後診断を効率化するDNA 脱メチル化特異的反応生成物の超高性能分析：タングステン酸によるワンポット検出法や銅TEMPOによる簡易検出法を開拓した。さらにゲノム中の86万か所の標的に対してこれらの化学反応を行ってヒト脳から新規のヒドロキシメチルシトシン塩基を見つけ出すことができた。
3． 肥満もしくはII 型糖尿病に直結するRNA メチル化に対する超高効率標識分子の設計：酵素によるm6A の認識に対して配列選択性を付与する。FTO のm6A 認識にはある程度の配列の
好みがあるものの、その限りではなかった。標的mRNA の配列に相補的な核酸配列を効率的に
FTOもしくはALKBH5に付与することによりm6Aの配列選択的標識が可能になるだろう。

Current Status of Research Progress

1: Research has progressed more than it was originally planned.

Reason

当初ヒドロキシメチルシトシンを検出するための化学反応を探索して見つけ出すことを目標にしていたが、タングステン酸によるワンポット検出法や銅TEMPOによる簡易検出法を開拓し、さらにゲノム中の86万か所の標的に対して反応を行ってヒト脳から新規のヒドロキシメチルシトシン塩基を見つけ出すことができた。当初予定していた化学反応の発見にとどまらず、ゲノムサイエンスにおける重大な発見にまで結びつけたことで、大きく研究が発展したと言える。

Strategy for Future Research Activity

メチルシトシン検出のための高感度化反応に取り組んでいるが、LT-FISH法を開拓したのでこれを応用すればメチル化DNAの高感度検出の道筋にめどをつけることができる可能性が出てきたので、さらなる進捗を図る。
研究協力者（臨床医）らと協力して、培養腫瘍細胞および腫瘍組織切片を用いて、連続反復配列・散在反復配列に対するMeFISH 実験を行う。メチル化検出感度についてのデータをフィードバックし、プローブの高感度化の改良を進める。MeFISH 実験から得られたイメージングデータに基づいて各細胞におけるメチル化量を解析し、腫瘍幹細胞を含む腫瘍組織の不均一性に関するデータ収集を進める。

Research Products

• [Journal Article] Chemically-activatable alkyne-tagged probe for imaging microdomains in lipid bilayer membranes (2017)
  • Author(s): Yamaguchi, S.; Matsushita, T.; Izuta, S.; Katada, S.; Ura, M.; Ikeda, T. ;Hayashi, G.; Suzuki, Y.; Kobayashi, Y.; Tokunaga, K.; Ozeki, Y.; Okamoto, A.
  • Journal Title: Sci. Rep. Volume: 7 Pages: 41007
  • DOI: 10.1038/srep41007
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Base-Resolution Analysis of 5-Hydroxymethylcytosine by One-Pot Bisulfite-Free Chemical Conversion with Peroxotungstate (2016)
  • Author(s): Hayashi, G.; Koyama, K.; Shiota, H.; Kamio, A.; Umeda, T.; Nagae, G.; Aburatani, H.; Okamoto, A.
  • Journal Title: J. Am. Chem. Soc. Volume: 138 Pages: 14178-14181
  • DOI: 10.1021/jacs.6b06428
  • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Chemically Activatable Alkyne Tag for Low pH-Enhanced Molecular Labeling on Living Cells (2016)
  • Author(s): Yamaguchi,S.; Ura, M.; Izuta, S.; Okamoto, A.
  • Journal Title: Bioconjugate Chem. Volume: 27 Pages: 1976-1980
  • DOI: 10.1021/acs.bioconjchem.6b00399
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Rapid nuclear import of short nucleic acids (2016)
  • Author(s): Kitagawa, M.; Okamoto, A.
  • Journal Title: Bioorg. Med. Chem. Lett. Volume: 26 Pages: 4568-4570
  • DOI: 10.1016/j.bmcl.2016.08.085
  • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] In vitro and in cell analysis of chemically synthesized histone H2A with multiple modifications (2016)
  • Author(s): Hayashi, G.; Sueoka, T.; Okamoto, A.
  • Journal Title: Chem. Commun. Volume: 52 Pages: 4999-5002
  • DOI: 10.1039/C5CC10555B
  • Peer Reviewed
• [Presentation] Chemical approach to nucleic acid diversity (2017)
  • Author(s): Akimitsu Okamoto
  • Organizer: JSPS-NRCT 2017 and IAMPS 33
  • Place of Presentation: タイ・バンコク
  • Year and Date: 2017-03-02 – 2017-03-03
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] 5-Hydroxymethylcytosine-Specific Oxidation: DNA -Friendly Cu(II)/TEMPO-Catalyzed Oxidation and Apprications (2016)
  • Author(s): Akimitsu Okamoto
  • Organizer: The 22th International Round Table on Nucleosides, Nucleotides and Nucleic Acids (XXII IRT)
  • Place of Presentation: フランス・パリ
  • Year and Date: 2016-07-18 – 2016-07-22
  • Int'l Joint Research