2015 Fiscal Year Annual Research Report
進化的に保存される脳カラム構造形成メカニズムとその機能
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15H02352
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| Research Institution | Institute of Physical and Chemical Research |
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Principal Investigator |
下郡 智美 国立研究開発法人理化学研究所, 脳科学総合研究センター, チームリーダー (30391981)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | 神経発生 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
Btbd3が過剰な樹状突起の除去を行っている事をこれまでに明らかにしているが、Btbd3にはRhoGAPなどのチューブリン構造を破壊するような活性ドメインが存在しない。そこで、Btbd3がどのように樹上突起を除去できるのか、その詳細なメカニズムを明らかにする目的でプロジェクトを行った。まずBtbd3には樹上突起を神経活動依存的に除去するドメインがない事から、Btbd3と相互作用しさらにRho活性を持つ因子の検索を行った。そこでyeast two hybrid の結果を用いてBtbd3と結合する因子の候補を絞り込み、pull down assayを用いて結合実験を行った。その結果、Btbd3と直接結合する事によってRho活性を上昇させる因子を同定した。この因子のノックアウトマウスの神経細胞の樹状突起の形態形成を調べると、Btbd3の欠損と同じように過剰な樹状突起の除去が行われていなかった。更に様々なBtbd3の変異体を用いて、結合するドメインの同定も行った。その結果、Btbd3のPHRドメインがお互いの結合に重要である事を明らかにし、さらにBtbd3は神経活動の上昇とともにリン酸化される事により、この因子のRhoの活性を上昇させる事が明らかとなった。しかし、神経活動がさらに上昇する事によって、Btbd3はこの因子と乖離しRhoの活性は低下しその樹状突起は安定化することを明らかにした。これらの結果から、一つの神経細胞で神経活動依存的に選択的な樹状突起を除去するメカニズムを明らかにした。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
Btbd3が過剰な樹状突起の除去を行っている事を明らかにしているが、Btbd3にはRhoGAPなどのチューブリン構造を不安定にし、樹状突起の除去を促すような活性ドメインが存在しない事から、別のタンパクとの結合によって樹状突起の選択的な除去を行っている事が推測された。そこで、Btbd3と結合することにより細胞骨格を変化させる事の出来る因子の単離、さらに神経活性を関知し入力が低い樹状突起を決定するセンサーとなるメカニズムの同定を行った。Btbd3と相互作用し樹状突起の除去を行う因子の候補として、PlexinA4がYeast Two hybrid の結果及びPlexinの in situ hybridization (ISH)の結果から考えられた。さらにPlexinA4のノックアウトマウスでは過剰な樹状突起の除去がおきていないことを明らかにした事からBtbd3 と相互作用して樹状突起の除去に関与している仮説を立てた。まず、Btbd3とPlexinA4の結合を調べた結果、Btbd3のPHRドメインを介して直接結合していることが明らかとなった。次にPlexinA4はBtbd3と結合することによってRhoの活性を上昇させ、樹状突起を除去することをin vivo, in vitroの結果から明らかにした。Rhoの活性の上昇にはPlexinA4が二量体を形成する必要がある事から、 Btbd3の結合がPlexinA4の二量体化に関わっている事が示唆された。そこでBtbd3の様々な結合実験を行い、Btbd3はBTBドメインを介して二量体を形成することにより、さらにBtbd3に結合したPlxnA4が二量体を形成できる事を明らかにした。さらにPlexinA4のRho活性の上昇には神経活動依存的なBtbd3のリン酸化が必要である事を明らかにした。しかし、神経活動がさらに上昇するとBtbd3はPlexinA4から乖離し、Rho活性の低下、さらには樹状突起の安定化が起きる事を明らかにした。これらのことから、神経活動のレベルによってコントロールされるBtbd3のリン酸化が選択的な樹状突起の除去／維持を可能にしていることを明らかにした。
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| Strategy for Future Research Activity |
今回発見した分子同士の相互作用とRho活性は多くの実験がin vitroの実験系を用いてそれぞれを検討したものであるため、この結果が実際に樹上突起内で神経活動依存的に同様の現象が確認できるのか検証を行う。まずは神経活動のレベルと、Btbd3のリン酸化、さらにRho の活性がリンクされているのかを分散培養系を立ち上げて検討する。これにはChR2を強制的に発現させた神経細胞を分散培養にして１本の樹状突起で神経活動を自由に変化できるようにした系を構築する。光を当てた樹状突起で、実際にCa流入が起きているかをGCaMPで測定し、Rhoの活性をFRETを用いて測定して、樹上突起で実際に分子の機能が神経活動依存的に変化するのかを明らかにする。
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