2017 Fiscal Year Annual Research Report

進化的に保存される脳カラム構造形成メカニズムとその機能

Research Project

Project/Area Number	15H02352
Research Institution	Institute of Physical and Chemical Research
Principal Investigator	下郡智美国立研究開発法人理化学研究所, 脳科学総合研究センター, チームリーダー (30391981)
Project Period (FY)	2015-04-01 – 2020-03-31
Keywords	樹状突起 / 臨界期 / バレル皮質
Outline of Annual Research Achievements	これまでの成果でBtbd3は神経活動依存的にPlxnA4と選択的に結合してRhoAの活性を上昇させ、樹状突起の除去を行っていることを明らかにした。PlxnA4がRhoAの活性を上昇させるには、2両体を形成する必要があることがすでに報告されていることから、様々なBtbd3の変異体を用いてプルダウンアッセイを行い、PHRドメインを介してPlxnA4と結合したBtbd3が、BTBドメインを介してBtbd3の二両体を形成し、結果としてPlxnA4が2両体を形成することを明らかにした。通常、PlxnA4の二両体の形成には細胞外でSemaが結合することが必要とされているが、我々の結果ではSemaのシグナルを介さずにRhoAの活性をコントロールしていることが示唆された。このことを検証するために、PlxnA4ノックアウトマウスに細胞外ドメインを欠損したPlxnA4を導入した結果、樹状突起の形態異常がレスキューされ、細胞内のBtbd3が直接PlxnA4の二両体化とRhoAの活性をコントロールしていることを明らかにした。次に、神経活動がさらに上昇すると、Btbd3とPlxnA4の結合が乖離することが明らかになり、この結果高レベルの神経活動下ではRhoAの活性が抑制されて、樹状突起の除去も抑制されることを明らかにした。加えて、PlxnA4と乖離したBtbd3はCadps2という因子と結合し、これによってRac1の活性を上昇させることを明らかにした。神経活動の低い樹状突起はBtbd3-PlxnA4コンプレックスによるRhoAの上昇で除去され、神経活動の高い樹状突起はBtbd3-Cadps2コンプレックスによるRac1の活性上昇によって枝分かれと伸長が促進されるという、樹状突起選択的な形態変化の分子メカニズムを明らかにすることができた。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 1: Research has progressed more than it was originally planned. Reason 神経活動の低い樹状突起はBtbd3-PlxnA4コンプレックスによるRhoAの上昇で除去され、神経活動の高い樹状突起はBtbd3-Cadps2コンプレックスによるRac1の活性上昇によって枝分かれと伸長が促進されるという、樹状突起選択的な形態変化の分子メカニズムを明らかにすることができた。これらは、ノックアウトマウス（PlxnA4, Cadps2）の解析、子宮内遺伝子導入法による遺伝子の過剰発現、Neuro2A細胞を用いたin vitroのプルダウンアッセイを用いて分子のインターラクションが神経活動の違いによって起きることを明らかにした。また、神経活動の違いが、RhoA, Rac1の活性をコントロールするメカニズムは、初代分散培養によるRaicyuタイプのRhoAおよびRac1の活性のFRETイメージング、初代分散培養によるGCamPのイメージングによって明らかにした。さらに、Btbd3の様々なミュータントを用いて、PlxnA4, Cadps2との結合ドメイン、およびPlxnA4の2両体化を行うことも明らかにし、詳細な樹状突起の形態変化に関わる分子メカニズムの詳細を明らかにした。現在はBtbd3のコンディショナルノックアウトマウスの解析も進んでおり、我々が明らかにした分子メカニズムをサポートする結果を得ている。このBtbd3のコンディショナルノックアウトマウスを用いて、Cre-ERコンストラクトの子宮内遺伝子導入を行い、時期特異的なBtbd３のノックアウトを作成し、臨界期以外の時期でのBtbd3の機能も明らかにする試みを行っている。またここまでの成果をin vivoで全て同時に観察する挑戦として、生後２日目の幼若マウスの２光子顕微鏡によるイメージング技術の立ち上げも行った。
Strategy for Future Research Activity	選択的な樹状突起の形態変化を起こす分子メカニズムを明らかにしてきたが、すべての実験方法はin vitroの結果であり、神経活動、RhoAまたはRac1の活性、形態変化をバラバラの系で見ており、トータルでのメカニズムは推測した結果である。この結果をさらに確証のあるものにするためには神経活動、RhoAまたはRac1の活性、形態変化のすべてを同時に観察することが必要となる。しかし、初代分散培養では樹状突起の形態変化を観察することは難しく、形態変化が起きる細胞は直後に細胞死を起こすケースが非常に多い。このために形態変化を含めた、樹状突起内でのイベントを明らかにするためにはin vivoでの2光子顕微鏡を用いたライブイメージングが必要となる。この技術を習得するために、ニューヨーク大学Wenbiao Gan教授との共同研究で、技術開発を行っている。しかし、幼若マウスのイメージングの最大の難点は、頭蓋骨が薄いことによるopen skullの難しさ、麻酔の調整の難しさ、人工保育が必要となることである。そこで、実験効率を上げるための工夫として、今後は臨界期が離乳後に起きる(生後３０日以降)フェレットの視覚野での２光子顕微鏡によるイメージングに取り組む。これまでの研究成果より、フェレットの視覚野での視覚入力依存的な樹状突起の形態変化にはBtbd3を中心とした同じ分子が働いている可能性を示唆する結果を得ている。そこで、あらかじめ子宮内遺伝子導入法で遺伝子導入したフェレットの視覚野を用いて、離乳(生後２８日)の後の臨界期で起きる視覚入力依存的な樹状突起の形態変化と神経活動のレベル、分子同士のインターラクションの状態を明らかにし、選択的な樹状突起の形態変化を起こす分子メカニズムの解明を行う。