2016 Fiscal Year Annual Research Report
マウス表現型に寄与するアレル発現量バイアスの原因シス制御配列の多型解析
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15H02412
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| Research Institution | National Institute of Genetics |
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Principal Investigator |
城石 俊彦 国立遺伝学研究所, 系統生物研究センター, 教授 (90171058)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 遺伝学 / ゲノム / 進化 / 発生制御 / 発生・分化 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は、表現型多様性の基盤となる対立遺伝子発現量比の歪み（アレル発現量バイアス）を検出し、発現量とエピゲノム状態との相関解析を通して原因シス多型を同定することを目的とする。これまでに、マウス亜種間交配由来のF1個体の共通なトランス因子環境下で、親となる両亜種由来系統のアレルの発現量の違いを評価する目的で以下の実験を行った。西欧産ドメスティカス亜種由来のB6系統と日本産モロシヌス亜種由来のMSM系統の交配によりF1個体を得て、その肝臓と成長軟骨を対象にアレル発現量バイアスを計測した。NGSによるRNA-seq解析には、新学術領域研究「ゲノム支援」の支援を受け、これまでにB6・MSM間で発現量が顕著に異なる遺伝子群をリストアップしている。また、コラゲナーゼ処理等により、マウス大腿骨から安定して成長軟骨部の細胞を調製する手法を確立した。この手法により調製した成長軟骨細胞についてATAC-seqによるオープンクロマチン領域の解析を行った。B6系統とMSM系統の成長軟骨に加えて、F1系統も用い、系統間で異なるオープンクロマチン領域のパターンを確認した。現在、その情報学的な解析が進行中である。また、シス多型の効果を検証するための評価系の構築を行った。B6とMSMからクローニングしたエンハンサー候補配列について、培養細胞を用いたルシフェレースアッセイを導入し、効率良く実際に機能するエンハンサー配列の同定を行うことができた。培養系で同定したエンハンサー配列について、個体での機能を確認するため、LacZを用いたレポータートランスジェニックマウスの作製とCRISPR/Cas9によるエンハンサー欠損マウスを作製した。これらの系統の表現型解析が進行中である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
ATAC-seqによる成長軟骨細胞のオープンクロマチン領域の解析をB6とMSMの正逆F1系統に展開し、共通のトランス因子環境においても亜種間で異なるエピゲノム状態を有する遺伝子座を探索した。現時点で、クロマチン状態に亜種間差のあるゲノム領域が複数明らかになっている。F1系統の情報解析と定量化については、すでに得られているB6、MSMの純系統のデータに加えて継続して行っている。また、F1系統マウス胚の消化器を対象として 、活性型エンハンサーの指標であるヒストンH3K27acと遺伝子の転写活性化領域の指標であるH3K36me3の抗体を用いて、ChIP-seq解析を行った。遺伝子の転写活性化とエンハンサーの活性状態の相関を明らかにする目的で情報解析が進行中である。さらに、ルシフェラーゼアッセイによる培養細胞を用いたエンハンサーの評価系を確立した。これまでにリストアップしたエンハンサー候補の一部をB6系統とMSM系統のゲノムDNAからクローニングし、レポーターとともに培養細胞に導入することで転写活性能の亜種間差を確認することができた。エンハンサー活性を有する配列については、マウス個体における機能を明らかにするため、レポータートランスジェニックマウスの作製を行い、マウス胚、肝臓でのレポーター発現の有無を検証している。肝臓でのアレル発現差を示す遺伝子について、エンハンサーの候補配列をCRISPR/Cas9系を利用して欠失させたマウス系統を樹立した。現在、対象遺伝子の発現レベルと表現型への影響を検証中である。
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| Strategy for Future Research Activity |
アレル発現量バイアスの大規模データを取得するためのRNA-seq並びにATAC-seqは、当初の計画に従って順調に遂行している。配列データの解析に当たっては、情報解析の研究協力者と連携してB6およびMSMの亜種間SNPを考慮した高精度の情報解析を行う。今後は、野生由来系統のゲノム多型データも使用して、アレル発現量バイアスと相関するシス制御配列上のSNPやIndelの絞り込みを行う。亜種間のアレル発現量バイアスを示す遺伝子と活性に差のあるエンハンサーの候補配列の機能連関を明らかにするため、培養細胞とマウス個体を用いたレポーターアッセイを進め、実際に機能するエンハンサー配列を同定する。表現型への寄与が強く予想されるエンハンサー配列に関しては、CRISPR/Cas9系を利用して、ゲノムから欠失させたマウス系統の樹立を行う。肝臓で機能するエンハンサーに関しては脂質代謝マーカーの発現、成長軟骨細胞で機能するエンハンサーに関しては骨格パターンと骨長をそれぞれ表現型の指標として、エンハンサー欠損の影響を評価する。
発現バイアスの効果がどのように集積し、個体の表現型多様性を生み出しているのか明らかにするために、遺伝子制御ネットワークに着目してマウス亜種間で発現バイアスを示す遺伝子群のネットワーク内での関係性を評価する。主に肝臓の脂質代謝と成長軟骨の増殖にかかわる遺伝子群に着目し、それらが共に発現変動するのかどうかを明らかにする。これらの解析を通じて、特定のマウス系統で活性化しやすい体質関連遺伝子のパスウェイを同定する。
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