2015 Fiscal Year Annual Research Report
感染植物アポプラストに分泌される植物－病原菌相互作用に関与するペプチド因子の同定
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15H02433
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| Research Institution | Nagoya University |
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Principal Investigator |
柘植 尚志 名古屋大学, 生命農学研究科, 教授 (30192644)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
花田 耕介 九州工業大学, 若手研究者フロンティア研究アカデミー, 准教授 (50462718)
望田 啓子 (桑田啓子) 名古屋大学, トランスフォーマティブ生命分子研究所, 助教 (70624352)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | 植物病理学 / 菌類 / 植物 / 病原性 / 抵抗性 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
Fusarium oxysporum病原菌は、宿主作物の根から侵入、導管（アポプラスト空間）内で蔓延し、萎凋・枯死を引き起こす。本菌と植物が対峙する導管には、菌が感染を成立させるための因子（エフェクター）を、また植物が菌の感染を阻止するための因子をそれぞれ分泌していると予想される。本研究では、これまで解析されていない低分子タンパク質（30～99アミノ酸）も対象とした感染植物の導管液プロテオーム解析によって、病原菌の新奇エフェクター、植物の新奇抗菌タンパク質の同定を目指す。今年度は、主に以下の研究を実施した。
メロンつる割病菌接種6または7日後に回収したメロン導管液のプロテオーム解析によって、菌由来の247個のタンパク質を同定した。それらのサイズ、推定機能、コードされる染色体、他の分化型や他の病原菌における相同遺伝子の分布などを整理・カタログ化するとともに、植物感染時の遺伝子発現をRT-PCRによって確認し、病原性遺伝子候補を選抜した。候補遺伝子のうち12個の破壊株を作出し、新奇な2個の病原性関連遺伝子を同定した。また、メロン由来の約1000個のタンパク質を同定し、それらのサイズ、推定機能、他の植物における相同遺伝子の分布などを整理し、カタログ化を進めている。
先に研究代表者は、本菌の病原性に不可欠な転写制御因子Fow2を同定した。野生株とFOW2変異株の最少培地培養時のRNA-Seq解析によって、上述した2個の病原性遺伝子を含む複数の導管液分泌タンパク質遺伝子がFow2によって制御されていることを見出した。
シロイヌナズナのアポプラストタンパク質を含む201個の低分子タンパク質について、それらの部分配列ペプチド（20アミノ酸残基）616個を合成し、それらの4種の植物病原糸状菌に対する抗菌活性を検定した。その結果、全ての菌に顕著な抗菌活性を示す15個のペプチドが見出された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
植物－微生物相互作用に関与する因子の同定を目的とする場合には、感染植物が最も理想的な材料であることは言うまでもない。近年の分析機器の高性能化とゲノム情報の整備によって、タンパク質を分離・精製することなく、網羅的に同定することが可能となり、あらためて感染現場に注目すべき時を迎えた。本研究では、導管液の前処理方法を検討するとともに、高性能LC-MS/MS装置を駆使したプロテオーム解析によって、メロンつる割病菌感染植物の導管液から菌由来の247個のタンパク質を同定した。植物病原菌が感染植物中で生産・分泌するタンパク質を同定した報告はあるが、これほど多数の菌由来タンパク質を同定した例はない。これらタンパク質をコードする遺伝子の破壊実験によって、新奇な2個の病原性遺伝子の同定に成功した。さらに、これら2個の遺伝子が、先に同定した病原性に不可欠な転写制御因子Fow2によって制御される遺伝子群に含まれることを見出した。この結果は、Fow2によって制御される遺伝子群との比較によって、病原性関連遺伝子をより効率的に同定することができることを示唆した。
低分子タンパク質も含めた約1000個のメロン由来導管液タンパク質を同定し、本研究で目的とする新奇抗菌タンパク質の探索のための情報も整理されつつある。また、シロイヌナズナの低分子タンパク質の合成部分ペプチドを用いて、供試した4種の病原糸状菌すべてに強い抗菌活性を示すペプチド、形態異常を引き起こすペプチドなどを見出しており、新奇抗菌タンパク質を同定するための実験システムも整った。
以上のように、今年度は、当初予定した研究をほぼ実施することができ、研究は順調に進展している。
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| Strategy for Future Research Activity |
導管液から検出した菌由来タンパク質の種々の特徴から、病原性関連因子として同定した2個の新奇タンパク質に加え、さらに20個ほどの病原性関連因子候補を選抜している。その中には、Fow2によって発現が制御される他のタンパク質も含まれ、Fow2が病原性関連遺伝子のマスターレギュレーターである可能性も考えられる。今後は、候補遺伝子の破壊株を順次作出し、病原性関連遺伝子群の網羅的な同定を目指す。
メロンつる割病菌と他のF. oxysporum病原菌、さらにそれらの宿主の反応を比較するために、トマト萎凋病菌（F. oxysporum f. sp. lysopercisi）感染トマトの導管液プロテオーム解析を実施する。萎凋病菌接種、非接種トマトから継時的に導管液を回収し、LC-MS/MS解析によって菌由来およびトマト由来のタンパク質を同定する。菌由来、トマト由来の導管液タンパク質のプロファイルを作成し、メロン導管液の情報と比較解析する。
抵抗性誘導剤（サリチル酸・ジャスモン酸）を処理したシロイヌナズナ葉の細胞間液のプロテオーム解析によって、分泌性の低分子タンパク質を同定する。メロンとトマトの結果も含め、各植物の分泌性低分子タンパク質をカタログ化し、それらから新奇抗菌タンパク質の同定を目指す。
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