2016 Fiscal Year Annual Research Report
感染植物アポプラストに分泌される植物－病原菌相互作用に関与するペプチド因子の同定
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15H02433
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| Research Institution | Nagoya University |
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Principal Investigator |
柘植 尚志 名古屋大学, 生命農学研究科, 教授 (30192644)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
花田 耕介 九州工業大学, 若手研究者フロンティア研究アカデミー, 准教授 (50462718)
望田 啓子 (桑田啓子) 名古屋大学, トランスフォーマティブ生命分子研究所, 特任助教 (70624352)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | 植物病理学 / 菌類 / 植物 / 病原性 / 抵抗性 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
Fusarium oxysporum病原菌は、宿主作物の根から侵入、導管（アポプラスト空間）内で蔓延し、萎凋・枯死を引き起こす。本菌と植物が対峙する導管には、菌が感染を成立させるための因子（エフェクター）を、また植物が菌の感染を阻止するための因子をそれぞれ分泌していると予想される。本研究では、これまで解析されていない低分子タンパク質（30～99アミノ酸）も対象とした感染植物の導管液プロテオーム解析によって、病原菌の新奇エフェクター、植物の新奇抗菌タンパク質の同定を目指す。今年度は、主に以下の研究を実施した。
前年度に、メロンつる割病菌（F. oxysporum f. sp. melonis）接種6または7日後に回収したメロン導管液のプロテオーム解析によって、菌由来の247個のタンパク質を同定した。今年度は、より病徴が軽度な接種5日後のメロン導管液のプロテオーム解析によって、新たに168個のつる割病菌タンパク質を検出した。これまでに同定した合計417個のつる割病菌タンパク質について、それらの特徴をカタログ化し、病原性関連遺伝子候補を選抜した。候補遺伝子のうち19個の破壊株を作出し、これまでに新奇な6個の病原性関連遺伝子を同定した。さらに、これらのうち5個が、先に同定した病原性に不可欠な転写制御因子Fow2によって制御されている可能性を見出した。
メロンつる割病菌と他のF. oxysporum病原菌、さらにそれらの宿主の反応を比較するために、トマト萎凋病菌（F. oxysporum f. sp. lysopercisi）接種、非接種トマトの7、9、11、13日後の導管液を採取し、プロテオーム解析を実施した。その結果、30個の低分子タンパク質（99アミノ酸以下）を含む1,025個のトマトタンパク質と233個の萎凋病菌タンパク質が同定された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
植物－微生物相互作用に関与する因子の同定を目的とする場合には、感染植物が最も理想的な材料であることは言うまでもない。近年の分析機器の高性能化とゲノム情報の整備によって、タンパク質を分離・精製することなく、網羅的に同定することが可能となり、あらためて感染現場に注目すべき時を迎えた。本研究では、導管液の前処理方法を検討するとともに、高性能LC-MS/MS装置を駆使したプロテオーム解析によって、メロンつる割病菌感染植物の導管液から菌由来の417個のタンパク質を同定した。植物病原菌が感染植物中で生産・分泌するタンパク質を同定した報告はあるが、これほど多数の菌由来タンパク質を同定した例はない。これらの情報をもとに、すでに新奇な6個の病原性関連遺伝子の同定に成功した。さらに、これらのうち5個の遺伝子が、先に同定した病原性に不可欠な転写制御因子Fow2によって制御されることが示され、Fow2によって制御される遺伝子群との比較によって、病原性関連遺伝子のより効率的な同定の可能性が示された。
また、トマト萎凋病菌接種、非接種トマトの7、9、11、13日後の導管液プロテオーム解析によって、30個の低分子タンパク質（99アミノ酸以下）を含む1,025個のトマトタンパク質を同定するとともに、それらの継時的な量的変化に関するデータも取得した。トマトの低分子タンパク質について、部分ペプチドを合成し、植物病原糸状菌に対する抗菌活性の検定も開始しており、本研究で目的とする新奇抗菌タンパク質の探索のための情報も整理された。
以上のように、今年度は、当初予定した研究をほぼ実施することができ、研究は順調に進展している。
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| Strategy for Future Research Activity |
導管液から検出した菌由来タンパク質の種々の特徴から、病原性に関与することを明らかにした6個のタンパク質に加え、さらに20個ほどの病原性関連因子候補を選抜している。次年度は、接種植物のRNA-Seq解析によって、つる割病菌の導管液分泌タンパク質遺伝子の感染時の発現パターンを経時的に解析し、候補遺伝子をさらに絞り込むとともに、遺伝子破壊による病原性関連因子の同定をさらに進める。
候補遺伝子には、Fow2によって発現が制御されている他のタンパク質も含まれており、Fow2が病原性関連遺伝子のマスターレギュレーターである可能性も考えられる。次年度以降は、Fow2によって制御される導管液分泌タンパク質遺伝子のさらなる探索、Fow2結合配列の同定などによって、Fow2による病原性の制御機構の解析を進める。
トマト萎凋病菌接種、非接種トマトの導管液プロテオーム解析によって同定した1,025個のトマトタンパク質、233個の萎凋病菌タンパク質について、得られたデータを整理し、菌由来および植物由来タンパク質のプロファイルを作成し、メロン－メロンつる割病菌相互作用と比較する。
トマト萎凋病菌接種、非接種トマトの導管液から同定した30個の低分子タンパク質について、部分合成ペプチドを用いて、植物病原糸状菌に対する抗菌活性を検定し、新奇な抗菌性タンパク質候補を選抜する。また、昨年度に同定したシロイヌナズナ葉の抗菌性低分子タンパク質も含め、候補タンパク質の機能同定をさらに進める。
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