魚類モノクローナル抗体遺伝子の新規探索法と抗体発現系の確立

2015 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 15H02461
• Research Institution: The University of Tokyo
• Principal Investigator: 浅川 修一 東京大学, 農学生命科学研究科, 教授 (30231872)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 大政 健史 大阪大学, 工学(系)研究科(研究院), 教授 (00252586) ; 近藤 秀裕 東京海洋大学, 海洋科学技術研究科, 准教授 (20314635) ; 田角 聡志 東京大学, 農学生命科学研究科, 助教 (90359646)
• Project Period (FY): 2015-04-01 – 2018-03-31
• Keywords: IgNAR / イヌザメ / サメ / トラフグ / ヤツメウナギ / 一本鎖抗体 / 人工抗体 / トランスクリプトーム

Outline of Annual Research Achievements

平成27年度はサメを対象に研究を行った。一本鎖抗体IgNARをもつサメ（イヌザメ: bamboo shark (Chiloscyllium punctatum, C. punctatum)）についてイルミナ社製、次世代シーケンサー Miseqを用いてトランスクリプトーム解析を行った。まず、飼育していたイヌザメ5匹から得られた末梢血の白血球を分画分離の後、cDNAライブラリの作製を行胃Miseqで解読した。得られたデータからIgNARの配列を抽出した。さらにIgM、IgW、IgLのcDNA塩基配列の取得も行った。得られた塩基配列はアミノ酸に翻訳し、データベースに登録されている他のサメや魚類（G. cirtatum、L. erinacea、S. acanthius、T. scyllium、S. canicula、O. maculatus、S. acanthias、R. productus、H. francisci、B. eastonlii、H. colliei、Danio rerio）と配列を比較した。その結果、サメ類で共通するIgNARの配列や定常部位の配列を抽出した。定常部位配列の発現を行い、２次抗体の抗原とするプロセスを進めた。またIgNARの可変部位のみを複数サンプルで効率良く解析するためのプライマーセットを設計し、運用を始めた。これらの研究成果は、平成27年度日本水産学会秋季大会と第38回日本分子生物学会・第88回日本生化学会合同大会（BMB2015）で発表を行った。ヤツメウナギに関しては、スナヤツメの稚魚を得て、飼育を開始した。トラフグに関しても飼育準備を進めた。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

本研究開始前より飼育していたサメ５匹より１年間にわたり採血を行いサンプルを得た。その後、得られた末梢血の白血球を分画分離の後、cDNAライブラリの作製を行うことができた。また、IgM、IgW、IgLに関する知見も得ることができた。ヤツメウナギの飼育を開始し、トラフグ飼育の準備を進めた。また二次抗体の抗原とするIgNAR定常部位の発現系の構築を進めた。これらのことによりおおむね順調に進展していると考えている。

Strategy for Future Research Activity

以下の内容を引き続き行う。
サメ、トラフグを対象に、抗原投入前後で採血を行い、次世代シーケンサーを用いて抗体遺伝子発現のトランスクリプトーム解析を行う。また、これらの魚種の抗体の定常部位を認識をするモノクローナル抗体を作成してELISA系を構築し、血清の抗体価の測定を行う。特定の抗原に対する抗体価の増減とトランスクリプトーム解析結果の関連解析を行い、特異的な抗体遺伝子の候補を絞り込む。絞り込んだ遺伝子をCHO細胞で発現し、抗原との結合を検証することにより、抗体遺伝子を同定する。具体的には以下の内容を行う。1)実験魚の飼育（サメ類のイヌザメ、トラフグ）。2)抗原投与前の採血、白血球分離、mRNAの抽出。3)イルミナ社製、次世代シーケンサーMiseqによる抗体遺伝子のトランスクリプトーム解析4)テスト抗原のBSAの投与。5)魚類抗体認識人工抗体の単離とELISA系の確立。6)抗原投与後の採血、白血球分離、mRNAの抽出、トランスクリプトーム解析：投与前と同様に投与後についても2)、3)のステップを進める。8)候補遺伝子の選抜と遺伝子合成：抗体価と発現量が関連する遺伝子群を抽出する。それから発現量、運動性の点で上位10個に遺伝子を選びcDNA全長を合成する。9)CHO細胞による発現：合成したcDNAをベクターに導入し、CHO細胞に導入して発現し、抗体分子を合成する。10)CHO細胞発現抗体分子の抗原に対する結合能の測定：CHO細胞で発現した抗体分子を精製し、抗原に対する結合能をELISA、ウェスタンブロット法で確認する。11)細胞パネルを用いたトラフグにおける重鎖・軽鎖遺伝子の対応関係決定系の確立：トランスクリプトーム解析は細胞ミックスで行うため、そのままでは重鎖・軽鎖の遺伝子の対応がつかない。そこで細胞のパネルを作製し、重鎖・軽鎖で発現パターンが一致するものを見い出す。スナヤツメについては抗体遺伝子レパートリーの把握を行う。

Research Products

• [Presentation] Preliminary identification of immunoglobulin isotypes in brownbanded bamboo shark (Chiloscyllium punctatum) by heavy chain constant domain analysis (2015)
  • Author(s): 2.De Silva, D.P.N., Tan, E., Mizumo, N., Kinoshita, S., Mitsuyama, S. And Asakawa, S.
  • Organizer: 第38回日本分子生物学会・第88回日本生化学会合同大会（BMB2015）
  • Place of Presentation: 神戸（神戸ポートアイランド）
  • Year and Date: 2015-12-01 – 2015-12-04
• [Presentation] Characterization of the immunoglobulin novel antigen receptor gene of brownbanded bamboo shark (Chiloscyllium punctatum). (2015)
  • Author(s): 1.De Silva, D.P.N., Tan, E., Mizumo, N., Kinoshita, S., Mitsuyama, S. And Asakawa, S.
  • Organizer: 平成27年度日本水産学会秋季大会
  • Place of Presentation: 仙台（東北大学川内北キャンパス）
  • Year and Date: 2015-09-22 – 2015-09-25