2016 Fiscal Year Annual Research Report
Sex specification of germline cells by epigenetic regulation in mice
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15H02472
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| Research Institution | Tokyo University of Agriculture |
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Principal Investigator |
河野 友宏 東京農業大学, 応用生物科学部, 教授 (80153485)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
小林 久人 東京農業大学, その他部局等, 准教授 (70632727)
外丸 祐介 広島大学, 自然科学研究支援開発センター, 教授 (90309352)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 始原生殖細胞 / ヒストン修飾 / Sry欠損性転換マウス / トランスクリプトーム解析 / 3Dイメージング |
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| Outline of Annual Research Achievements |
生殖系列細胞の特性を明らかにするために、本年度は、以下の成果を得た。１） 包括的ヒストン修飾解析： 我々が構築した少数細胞を対象としたChIP-Seq解析によりE13.5雌雄始原生殖細胞（PGC）の包括的ヒストン修飾解析を実施した。 ChIP-Seq解析は、１x10(-4)個の雌雄PGCを対象とし、Native ChIP-Seqを行い、H3K4me1, H3K4me3, H3K9me3, H3K27me3 およびH3K27acの６ヒストン修飾のゲノムワイドな情報取得に成功した。現在詳細な比較解析を実施しているが、既にDNAメチル化が消去した時期のPGCにおいて雌雄間にヒストン修飾の差異が明らかになっている。２）Sry欠損性転換マウスを作出：CRISPR/Cas9を用いたゲノム編集により作出したSry欠損性転換マウスを作出した。XY雌PGCのトランスクリプトーム解析を実施し、XX雌PGCとの発現差を示す遺伝子群を明らかにした。さらに、不妊の原因を探り、PGCおよび卵母細胞数の顕著な消失の実態について明らかにした。３）トランスクリプトーム解析：現在Fluidigm社IFC chip および C1 Single-Cell Auto Prep System method を用いたE7.5日胚PGC前駆細胞のシングルセルトランスクリプトーム解析を進行している。Mil1-EGFP-TGマウスからサンプリングし、mRNAseq解析に着手したところである。４）３Dイメージング解析： XY雌、XX雌およびXY雌生殖巣におけるPGCおよび支持細胞の３Dイメージング解析を実施した。大変興味深いことに、E13.5のPGC数は約12,000と定説の半数であること、さらに、この時点で増殖を停止せず、雌ではE16.5まで、一方雄ではE18.5まで増殖が継続していることが判明した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
トランスクリプトーム解析については、XX雌-PGC, XY雄-PGC, XY雌―PGCの比較解析を完了することができ、差次的発現遺伝子群の検出に成功している。これにより、E13.5のPGCにおいて性分化の初動の全容が初めて明らかになったことから、当初目標を上回って進展している。一方、PGC分化初期のシングルセル-トランスクリプトーム解析では、Fluidigm社からのキットの供給が大幅に遅れ（１年）当初計画から、若干の遅れとなっている。ただし、現在精力的に実験を進めていることから、29年度には成果が得られると確信している。
ヒストン修飾解析は、すこぶる順調に成果を挙げており、DNAメチル化消去後のPGCにおけるエピジェネテクス修飾による遺伝子発現制御の実態が明らかになるものと期待できる。当然、雌雄生殖系列細胞の分化におけるエピジェネテクス制御の実態が明らかになることが期待される。
CRISPR/Cas9を用いたゲノム編集による性転換XY雌の作出は非常に効率的で、当初目標を上回る成果に結びついた。XY雌PGCの特性については現在論文を取りまとめている。XY雌不妊の実態を、交配試験、トランスクリプトーム解析、免疫染色などの手法を用いた詳細な成果を報告する。３Dイメージング解析では、当初目標を上回る詳細な解析結果が得られ、従来の定説を覆す成果が得られたことは重要な意味を持つ。また、その波及効果も大きい。
以上の全体として概ね順調に進行していると評価できる。
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| Strategy for Future Research Activity |
これまでに雌雄始原生殖細胞におけるトランスクリプトームデータ取得およびChIP-seq解析によるヒストン修飾データの取得、さらには、ゲノム編集によるSry-KO XY雌マウスを作出し、性転換雌マウスの特性について解析を進めてきた。
そこで最終年度は、１）包括的ヒストン修飾解析では、我々が構築した少数細胞を対象としたChIP-Seq解析によりE13.5雌雄始原生殖細胞（PGC）の包括的ヒストン修飾解析データとトランスクリプトームデータの比較解析を実施し、雌雄始原生殖細胞におけるヒストン修飾の性差と性分化誘導ついて解析する。２）トランスクリプトーム解析では、マイクロRNA(miRNA)およびstranded-RNA-seq解析を対象に加え、実施して新たな情報の取得にチャレンジする。３）性転換マウスの特性解析では、 CRISPR/Cas9を用いたゲノム編集によりSry欠損による性転換マウスを作出し、不妊となる原因についてさらに追究する。具体的には、（１）卵巣の病理組織学的な解析から、卵子形成異常の状況を詳細に把握する。（２）性転換マウスから得られたXY卵子の排卵、受精能および発生能をそれぞれ解析する。（３）排卵卵子における単一卵子トランスクリプトーム解析を実施し、発現異常を示す遺伝子群を特定する。
これらの解析データを総合的に比較解析して、雌雄始原生殖細胞における性分化特定のメカニズムについて、特にエピゲノムの観点から解明するとともに、性転換雌マウスにおける不妊の原因の究明を図る。
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