2015 Fiscal Year Annual Research Report
iPS細胞を用いた肺の臓器再生と疾患病態解明のための革新的バイオリソースの開発
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15H02537
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
三嶋 理晃 京都大学, 医学(系)研究科(研究院), 名誉教授 (60190625)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
瀬山 邦明 順天堂大学, 医学部, 准教授 (10226681)
半田 知宏 京都大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (10432395)
浅香 勲 京都大学, 学内共同利用施設等, 教授 (10543639)
平井 豊博 京都大学, 医学(系)研究科(研究院), 准教授 (20359805)
金 永学 京都大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (20456883)
谷澤 公伸 京都大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (20639140)
佐藤 篤靖 京都大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (30706677)
佐藤 晋 京都大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (40378691)
伊藤 功朗 京都大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (40447975)
長崎 忠雄 京都大学, 医学(系)研究科(研究院), その他 (40747862)
堀田 秋津 京都大学, 学内共同利用施設等, 助教 (50578002)
小熊 毅 京都大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (50601324)
後藤 慎平 京都大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (50747219)
室 繁郎 京都大学, 医学(系)研究科(研究院), 講師 (60344454)
松本 久子 京都大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (60359809)
小笹 裕晃 京都大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (80572015)
永井 宏樹 京都大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (80711605)
陳 和夫 京都大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (90197640)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 分子細胞呼吸器学 / iPS細胞 / 肺臓器再生 / 疾患モデリング |
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| Outline of Annual Research Achievements |
肺臓器の再生について、まずはヒトiPS細胞から分化誘導させたII型肺胞上皮細胞はヒト由来細胞が定着しやすいとされているＮＯＧマウスの腎皮膜下になかなか定着が確認できず、工夫を要した。iPS細胞を用いた疾患病態研究についてはまず、ＣＰＭによる前駆細胞の単離や三次元培養だけでは気道や肺胞上皮細胞の効率よく安定した分化誘導が難しく、培地の組成などの条件検討を要し、それぞれより安定した効率のよい分化誘導法を確立するという課題から開始することになった。その結果、気道上皮も肺胞上皮細胞も効率よく分化させることができるようになったが、機能評価については容易ではなかった。気道繊毛上皮細胞の場合は三次元培養のままでは振動数や粘液繊毛クリアランスの定量化が技術的に難しかったため、分化の途中で平面に播きかえて繊毛上皮細胞を生やす手法を確立した。大阪大学月田研究室との共同研究も行い、蛍光ビーズをヒトiPS細胞由来の気道繊毛上皮細胞の上に乗せて、その動きをトラッキングすることにより定量化する手法を確立した。また、ヒトiPS細胞由来の気道繊毛上皮細胞はヒト成人肺から採取された気道繊毛上皮細胞と同等の振動数を有することも分かり、この成果は世界初の画期的なもので論文として報告するに至った(Konishi et al. Stem Cell Reports, 2016)。疾患病態モデルの作成にあたっては、CRISPR-CAS9を用いた遺伝子改変技術をiPS細胞研究所の堀田助教から技術指導を受けノックアウトや相同組み換え用の各種ベクターを作成した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
肺臓器の再生については、ヒト由来細胞が定着しやすいとされているＮＯＧマウスの腎皮膜下に移植を試み、1ヵ月後に腎臓を摘出して凍結切片を作成したが、定着は確認できなかった。そこで、初代細胞の線維芽細胞、血管内皮細胞を混ぜて細胞集塊としたもの「肺オルガノイド」をNOGマウスの腎臓被膜下に移植したところ、1ヵ月以上にわたり細胞が定着することを確認できたので、さらに期間を延長しながら、各呼吸器上皮細胞の成分を免疫染色などで確認中である。。iPS細胞を用いた疾患病態研究については、難治性呼吸器疾患患者の体細胞の入手が難しい場合には健常者由来のiPS細胞に対して遺伝子改変を行うことで、病態を再現する手法を採用することにした。また、すでに樹立されていたHermansky-pudlak症候群の疾患特異的iPS細胞についてはトランスジェニック法による遺伝子のレスキューが分化を不安定化させる傾向があったため、CRISPR-CAS9による相同組換え法に切り替え、遺伝子を修復するためのターゲティングベクターを作成した。
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| Strategy for Future Research Activity |
「肺オルガノイド」をＮＯＧマウスの腎皮膜下に定着させる手法については、今のところ２ヶ月以上の時間をかけた方が定着している細胞が組織状になるため、分化状態を評価しやすいと考えている。このため、より時間をかけた細胞の定着状態について評価していく予定である。また、肺への移植について、肺障害を伴わないＮＯＧマウスでは細胞が定着しなかったため、今後はＮＯＧマウスを使った肺障害モデルに対して、「肺オルガノイド」の定着実験を試みる予定である。iPS細胞を用いた疾患病態研究については、健常者由来のiPS細胞や患者由来の疾患特異的iPS細胞の未分化な状態に対して、CRISPR-CAS9をはじめとする遺伝子改変を行い各疾患モデルの確立に必須の細胞株の樹立を進めていく予定である。
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[Journal Article] Directed induction of functional multi-ciliated cells in proximal airway epithelial spheroids from human pluripotent stem cells.2016
Author(s)
Konishi S, Gotoh S, Tateishi K, Yamamoto Y, Korogi Y, Matsumoto H, Muro S, Hirai T, Ito I, Tsukita S, Mishima M.
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Journal Title
Stem Cell Reports
Volume: 6
Pages: 18-25
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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[Journal Article] Longitudinal shape irregularity of airway lumen assessed by CT in patients with bronchial asthma and COPD.2015
Author(s)
Oguma T, Hirai T, Fukui M, Tanabe N, Marumo S, Nakamura H, Ito H, Sato S, Niimi A, Ito I, Matsumoto
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Journal Title
Thorax
Volume: 70(8)
Pages: 719-24
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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[Journal Article] Matrix metalloproteinase-10: a novel biomarker for idiopathic pulmonary fibrosis.2015
Author(s)
Sokai A, Handa T, Tanizawa K, Oga T, Uno K, Tsuruyama T, Kubo T, Ikezoe K, Nakatsuka Y, Tanimura K,
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Journal Title
Respir Res
Volume: 16
Pages: 120
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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