2016 Fiscal Year Annual Research Report
網羅的exome解析による敗血症関連遺伝子の探索と個別化医療への展開
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15H02568
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| Research Institution | Chiba University |
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Principal Investigator |
中田 孝明 千葉大学, 医学部附属病院, 講師 (20375794)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
安部 隆三 千葉大学, 医学部附属病院, 講師 (30375795)
関根 章博 千葉大学, 予防医学センター, 教授 (30425631)
織田 成人 千葉大学, 大学院医学研究院, 教授 (90204205)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | 敗血症 / 遺伝子多型 / exon / 救急 / 集中治療 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
敗血症は依然致死率が高く，新規発見が必要な重要課題である．遺伝的要因の個人差である遺伝子多型が敗血症の転帰に影響を与えることが広く知られている．これまでの遺伝子多型研究成果は選択する候補遺伝子に制限されている．この制限を解消するために全ゲノム上の重要領域(exome)を網羅的に解析することが本研究の主目的である．敗血症患者において炎症反応の程度を反映する指標として血中IL-6濃度が有用であることが知られている． 本研究ではIL-6高値を呈した敗血症ショック症例（n=100）を対象として，Illumina HiSeq 2000/2500 platformを用いてwhole exome sequencing解析，及び，敗血症症例（n=300）を対象としたgenome-wide association study 解析用のGWAS array(Omni2.5M+exon)を用いた網羅的遺伝子多型解析を行う予定である．2016年度は，千葉大学医学部倫理審査委員会の倫理審査承認後に収集している多施設の敗血症症例のIL-６血中濃度測定を行なった．また，上記の対象症例の詳細なphenotype dataの収集及びDNA抽出を行なった．また2017年度のwhole exome sequencing・GWAS arrayの本解析に向けたテストランを行った．またIL-6は炎症性サイトカインの代表であるが，炎症性サイトカインのみならず抗炎症性サイトカインも敗血症症例の病態に重要な役割を果たすと考えられる．そのため，抗炎症性サイトカインの代表であるIL-10 family geneに関してtag SNP法を用いて候補SNPsを選出し，genotypingを行ない，転帰との関連を解析した．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究は，敗血症患者の臨床転帰と関連する遺伝的素因を探索すべく，全ゲノム上の重要領域(exome)を網羅的に解析することを目標に計画された．2016年度は，当初の研究計画のように，最終目標の一つである敗血症患者に対してwhole exome sequencingを行うべく，予定通りに進展している．また，より多くの有意義な網羅的解析結果を得るべく，敗血症性ショックを対象としたwhole exome sequencing を用いた遺伝子解析に加えて，敗血症を対象としたgenome-wide association study 解析用のGWAS array(Omni2.5M+exon)を用いた網羅的遺伝子多型解析を行うことを目標の一つとしている．そこで，2 016年度は，これらのために必要な予備実験やサンプル・データ収集・サンプル調製を順調に進めてきている．またwhole exome sequencingを用いた解析は敗血症性ショック患者に限定し，また炎症性サイトカインであるIL-6をマーカーとして行うため，抗炎症性サイトカインに関する解析を追加することで解析範囲が広がり，より多くの候補遺伝子多型を発見できると考えた．そこで敗血症患者を対象として，IL-10ファミリー遺伝子（IL-10, 1L-19, IL-20, IL-24）を含む200 kbの遺伝子領域の解析を追加して行い，より広範囲に重要な遺伝的素因を網羅的に解析している．
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| Strategy for Future Research Activity |
敗血症ショック患者を対象にIllumina HiSeq 2000/2500 platformを用いてwhole exome sequencing解析を行う．敗血症患者を対象にgenome-wide association study 解析用のGWAS array(Omni2.5M+exon)を用いた網羅的遺伝子多型解析を行う予定である．IL-10ファミリー遺伝子（IL-10, 1L-19, IL-20, IL-24）を含む200 kbの遺伝子領域の解析を行う．型Primary outcomeは28日生存で解析する．導出された遺伝子多型に関して遺伝子発現を解析する．
遺伝子発現との関連が認められない場合で，アミノ酸合成による異常タンパク産生をおこすミスセンス変異の場合は，遺伝子変異がタンパク質の機能に与える影響をSIFT，Polyphen2などの解析ソフトウエアによる機能解析を行い，遺伝子多型に起因するアミノ酸変異がタンパク質に与えるdamaging effectの大きさを算出し，機能解析を行う遺伝子多型の優先順位を決定し，遺伝子変異導入・解析を行う．
既存の報告に依存せずに網羅的に新規遺伝子多型発見を目指す本研究の特徴上，遺伝子自体の機能が解明されていない遺伝子の遺伝子多型が同定される可能性が期待される．細胞・動物実験を用いて発見したターゲット遺伝子をknock down, knock out, over expressionし， 敗血症刺激下でのターゲット遺伝子の役割を明らかにすることも重要な検証実験と考え，得られた結果によっては行うことを検討する予定である．
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