2016 Fiscal Year Annual Research Report
クラスターDNA損傷に対する細胞内修復動態と損傷の局在化メカニズム
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15H02823
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| Research Institution | National Institutes for Quantum and Radiological Science and Technology |
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Principal Investigator |
横谷 明徳 国立研究開発法人量子科学技術研究開発機構, 高崎量子応用研究所 東海量子ビーム応用研究センター, 上席研究員(定常) (10354987)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
渡辺 立子 国立研究開発法人量子科学技術研究開発機構, 高崎量子応用研究所 東海量子ビーム応用研究センター, 主幹研究員(定常) (10360439)
秋光 信佳 東京大学, アイソトープ総合センター, 教授 (40294962)
岡 壽崇 東北大学, 高度教養教育・学生支援機構, 助教 (70339745)
鵜飼 正敏 東京農工大学, 工学(系)研究科(研究院), 教授 (80192508)
福永 久典 東北大学, 大学病院, 医員(研修医) (50781267) [Withdrawn]
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | クラスターDNA損傷 / 修復動態 / DNA電子物性 / シンクロトロン放射 / 蛍光タンパク質 / 内殻イオン化 / DNAラジカル / Auger電子 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
mCherry蛍光タンパク質を含むプラスミドDNAに対し100～200GyのX線を照射した後、これをヒト細胞（HeLa）細胞へ導入した。フローサイトメータを利用して形質転換効率を調べたところ、100Gyではほとんど影響を受けず、また200Gyでは60％程度であった。これらの結果から、mCherryを切り出して照射しプラスミドに再結合するこれまで行ってきた操作の必要が無いことが分かった。また、イオンビームやX線を照射したプラスミドDNAに対する塩基除去修復酵素の作用機序から、実際のクラスター損傷部位を構成する個々の損傷間の距離に関する知見を得て、論文として発表した。SPring-8から得られる酸素及び窒素のK殻吸収端近傍の単色シンクロトロン軟X線の照射条件の検討も、現在進めている。DNAの電子物性とDNA周囲の水和水構造がどのように損傷誘発に関わるかを理解するためには、DNAの糖（デオキシリボース）の分解プロセスについて量子化学計算も必要である。フランスのグループとの共同研究によりこれを実施し、計算結果はが実験で得られている分解生成物（フラグメントイオン）のパターンと良く一致する結果を得、現在論文として投稿中である。内殻イオン化の結果生じるオージェ電子の作用についても、モンテカルロシミュレーションを実施し論文として発表した。さらに不安定なDNA塩基ラジカルを、単色軟X線を照射しながらその場測定を行った結果、塩基の持つ官能基に依存してラジカル収率が大幅に変わることを見出した。DNA損傷に至る反応中間体であるラジカル生成メカニズムに関してこれまで知られていない重要な知見であり、論文として投稿する準備を進めている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
mCherry蛍光タンパク質を含むプラスミドDNAに対し100Gy程度のX線を照射しても、ヒト細胞（HeLa）細胞への形質転換効率がほとんど影響受けないことを見出した。そこでこれまでの方針を転換し、mCherry遺伝子部分の切り出しとプラスミドへの再結合の操作を全てカットすることで、大幅に実験を簡略化することに成功した。プラスミドへの照射とこれをヒト細胞に導入した後のライブセル観察を開始した。またシンクロトロン軟X線の照射条件の検討を進めたが、緩衝液の塩を除くことによる鎖切断頻度が数10％は起こってしまうため、引き続き実験条件の検討を行っている。
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| Strategy for Future Research Activity |
照射用プラスミド試料の作成と照射後の細胞への導入方法が、大幅に簡略化できることが分かり、実験の進捗のスピードが上がった。またDNA中の特定元素の内殻イオン化に特有の損傷過程を調べるためには、DNAを構成する元素と同じ元素（C, N, O, P）を含む緩衝液の塩を試料から除くことが必須であり、これによるDNA分子の不安定化の克服が鍵となる。薄膜を吸着させるための基板を、これまでのガラス以外にもプラスティックなどDNAとの吸着性が低い材料を検討する。、
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[Presentation] 電子線トラックエンドの放射線最初期過程の研究2016
Author(s)
甲斐 健師, 横谷 明徳, 鵜飼 正敏, 藤井 健太郎, 渡辺 立子, 米谷 佳晃, 樋川 智洋, 佐藤 達彦
Organizer
第59回放射線化学討論会
Place of Presentation
量子科学技術研究開発機構 高崎量子応用研究所
Year and Date
2016-09-20 – 2016-09-22
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