2016 Fiscal Year Annual Research Report
早期糖尿病における蛋白漏出の機能的かつ遺伝子を含めた構造的解明
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15H03012
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| Research Institution | Kawasaki Medical School |
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Principal Investigator |
仲本 博 川崎医科大学, 医学部, 助教 (10299183)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
矢田 豊隆 川崎医科大学, 医学部, 講師 (00210279)
小笠原 康夫 川崎医科大学, 医学部, 准教授 (10152365)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 共焦点顕微鏡 / 糸球体濾過 / 遺伝子 / 蛋白漏出 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
倒立型顕微鏡について
共焦点レーザー顕微鏡を改良して倒立観察を可能とすべく、照射レーザー光路を変換するオブジェクティブ インバーターを導入した。これによって、生理的自発呼吸下のラットやマウスの腎微小循環の観察が可能となり、しかも自重による察窓に上部からの適度な圧迫を利用して呼吸運動による移動を除去することが出来た。この事により、尿細管内の流れも精密に計測することが出来るようになった。そこで、尿細管への色素の濾過を計測することで、単一ネフロン糸球体濾過率 (SNGFR)を簡便に求めることを試みた。尿細管の２点間を通過する時間と距離と尿細管径から、直ちにSNGFRを求めることが出来た。これまで、単一ネフロンにおいては、微小穿刺法を用いて血中、尿中のクレアチニン乃至それに相当するほぼ糸球体で100パーセント濾過される物質の濃度を計測して求めなければならなかった。この成果は、2017年３月の微小循環学会で発表した。
スリット膜の遺伝子解析について
早期糖尿病では、過剰な糸球体濾過がある。我々は、以前この過剰濾過を可視化し、腎不全の顕在化する後期ではなく、早期から糸球体レベルで蛋白の漏出があり、それが糖尿病の進行に伴い増悪することを報告している。今回、２ヶ月の１型の早期糖尿病のラットを用い、腎糸球体スリット膜の構成要素であるCD2APの遺伝子発現と蛋白量を測定した。逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)で発現を調べたところ、糖尿病ラットとコントロール群では有意な差は認められなかった。然るに、ウェスターン ブロッティングで蛋白量を調べたところ、糖尿病ラットでは、有意に減少していることが判明した。この減少が、糖尿病早期の糸球体レベルでの蛋白の漏出の原因の一つであることが示唆される。この成果は、2016年９月の微小循環学会で発表した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
倒立型の顕微鏡追加ユニットの導入は、導入後首尾は上々で微小循環の観察に貢献している。スリット膜の遺伝子レベルでの解析は、ネフリン、ポドシン、CD2APについて行なっているが、ウェスタン ブロッティングの解析条件の設定が当初の予定通りには行かず、目処のついて来たのは、ネフリンだけである。また、糖尿病の期間をもう少し延長すると、蛋白量の差異が鮮明となると考えられる。以上の理由から、数ヶ月遅れてはいるが、結果が出せるものと踏んでいる。
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| Strategy for Future Research Activity |
１年目の予定は、ほぼ達成している。２年目は、やや遅れているものの数ヶ月で結果が出るであろう。３年目の予定については、一点記述しておかねばならないことがある。ARBは、ロサルタンが静脈ではなく腹腔内投与が可能であることが判明したので、投与はこの方法を用いる。
本年度予定している内容。ラットはコントロール、コントロール＋C-peptide、糖尿病、糖尿病＋C-peptideの群に分けまず、血管内をFITCで標識した500kDaの高分子デキストランを投与しておく。麻酔下のラット腎表面に切開を加え開発した生体顕微鏡システムで腎糸球体微小循環を観察し、ビデオに録画しデータを得る。濾過の定量評価には、Texas Redで標識した3k, 10k, 40k, 70k Daのデキストランをボーラス投与して濾過を多光子共焦点レーザー顕微鏡で可視化する。ARBの投与前後で、各デキストラン分子の濾過の変化を観測、記録する。
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