2016 Fiscal Year Annual Research Report

Development of ultrasound-responsive nanobubbles containing physiologically active gas and construction of disease treatment system

Research Project

Project/Area Number	15H03037
Research Institution	Tokyo University of Pharmacy and Life Science
Principal Investigator	根岸洋一東京薬科大学, 薬学部, 准教授 (50286978)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	丸山一雄帝京大学, 薬学部, 教授 (30130040) 高木教夫東京薬科大学, 薬学部, 教授 (50318193)
Project Period (FY)	2015-04-01 – 2018-03-31
Keywords	生理活性ガス / 超音波 / バブルリポソーム
Outline of Annual Research Achievements	本年度計画では、NOガス内封バブルリポソームの調製法の最適化を進めた。１）NOガス内封バブルリポソームの調製法の最適化－前年度までに使用したリン脂質とは異なるカチオン性脂質についてもリポソームを調製し、それらへのNOガスの内封を試み、中性脂質を利用したバブルとの比較検討を行った。結果、C3F8を用いて、バブル化した際には、いずれの構成脂質を含有したバブルリポソームにおいても粒子径が500‐700 nm程度であるのに対し、NOガスを内封させることで、粒子径が1000‐1200 nmとなることが示された。NOガスの内封を一酸化窒素（NO）検出用蛍光試薬であるDAF-2を用いて調べたところ、ガスの内封が確認された。さらにin vivoにおける安定性について造影効果を指標に中性脂質を利用したバブルと比較検討した。カチオン性脂質を用いて調製したNOガス内封バブルリポソームをマウスに静脈内投与し、その後の造影効果を調べた場合では、投与5分以内で減少し不安定であることが判明した。さらにNOの内封条件（脂質の組み合わせや物理的混合条件等）を変えることで、バブルの粒子径をコントロールでき、総脂質あたりのNO含有量を増加できることも明らかとなった。２）標的指向性バブルリポソームの調製法の最適化‐活性基が導入されたPEG脂質を添加し、そこに標的指向性を有するペプチド等の修飾を適宜行い、リガンドへの結合性を評価した。新生血管や炎症部位を標的化するペプチドを導入したものを用いて、リポソームのペプチド修飾を行った。HUVEC細胞との相互作用性を調べるために蛍光物質でラベルしたペプチド修飾リポソームを、細胞に添加し、蛍光顕微鏡にて評価した。その結果、ペプチド修飾に依存した細胞相互作用性が認められたことから、本ペプチド修飾リポソームは、NOを選択的に送達する有用なリポソームになりえるものと期待された。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 本年度では、様々な構成脂質によるNOガス内封バブルリポソームの調製法の最適化を進めた。中性脂質と他のカチオン性脂質を構成脂質として、NOガス内封バブルリポソームを作製し、比較検討したところ、in vitro、in vivo実験において、中性脂質のNOガス内封バブルリポソームは、非常に安定であることが示された。また、NO内封条件の最適化の検討により、混合条件によりNO含有量が2倍近く変動すること、粒子径をある程度コントロールできることも示された。さらにNO内封用のターゲティングリポソームの調製も可能となったことから、本研究は、おおむね順調に進展していると考えられる。
Strategy for Future Research Activity	最終年度計画では、昨年度までに最適化されたNOガス内封バブルリポソームを用いて、in vitro, in vivo実験系にてNOデリバリーシステムの有用性を明らかにする。１）In vitro NOデリバリーシステムの確立-昨年度までに最適化されたNOガス内封バブルリポソームを血管内皮細胞や種々の培養細胞に添加することで、細胞内へのNOデリバリーが可能か否かについて、細胞内NO検出試薬であるDAF-FM等を用いて、蛍光顕微鏡にて評価する。デリバリー効率を図るために細胞選択的ペプチドを修飾したNOガス内封バブルリポソームを用いて細胞内へのNOデリバリーも同様に行う。２）In vivo NOデリバリーシステムの確立-NOガス内封バブルリポソームを正常マウス体内への尾静脈投与し、体外からの超音波照射を行い、照射部位におけるNO作用をエバンスブルーやナノキャリアの移行量を指標に本バブルの有用性を評価する。結果を踏まえ、超音波照射強度の最適化を進める。さらにNOデリバリーの効率化を目的としたリガンド修飾NOガス内封バブルリポソームあるいはリガンド未修飾NOガス内封バブルリポソームを用いて、同様の実験を下肢虚血性モデルマウスや腫瘍モデル等に対して実施し、生理学的、または生化学的手法により、その効果を調べる。上記の検討によりNOデリバリーシステム構築の可能性を明らかにする。