2015 Fiscal Year Annual Research Report
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15H03116
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| Research Institution | Keio University |
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Principal Investigator |
井本 正哉 慶應義塾大学, 理工学部, 教授 (60213253)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
斉木 臣二 順天堂大学, 医学部, 准教授 (00339996)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | オートファジー |
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| Outline of Annual Research Achievements |
蛍光タンパク質EGFPとmCherryをN末端側に融合したLC3B (tf-LC3)を細胞に発現させることでオートファジーが定量的に検出できる．そこでtf-LC3遺伝子を発現できる高力価のレトロウイルスを作製し，HeLa, PC12D細胞に感染させることでtf-LC3を一過的かつ安定的に発現させることに成功した．
ヒト神経芽細胞腫SH-SY5Y細胞にMPP+を処理すると細胞内にα-Synucleinを含む凝集物が蓄積し，MPP+とSO286を共処理するとα-Synuclein凝集物の蓄積は抑制された．これまでにSO286の結合タンパク質(SOBP)を同定している．SOBPwo
ノックダウンすることでα-Synucleinの凝集が観察されること，またこのSOBPのノックダウン細胞にSO286を添加してもMPP+によるα-Synuclein凝集物の蓄積が抑制されなかったことから，SO286の凝集物蓄積阻害作用にSOBPが関与していることが示唆された．
レトロウイルスベクターに，short hairpin RNA (shRNA) -Atg7を発現するプラスミドを作製した．このプラスミドを用いてHEK293T細胞培養上清中にレトロウイルスを産生させた．このレトロウイルスを標的細胞であるA549, PC3細胞に感染させることで，細胞内でAtg7をノックダウンするshRNAを恒常的に発現する安定細胞株の樹立に成功し，オートファジー細胞死を簡易に評価可能な実験系の構築を実現した．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
mCherry-EGFP-LC3B発現細胞の安定発現細胞を用いてオートファジーの評価を試みたが，細胞の継代を重ねるたびにm-Cherryの赤いドットが蓄積し，正確なオートファジーの定量が困難であった．そこで，レトロウイルスによる発現方法に変更した．このことにより当初予定より若干の計画の遅れが生じた．SO286の標的分子についてはほぼ特定することができた．オートファジー細胞死誘導物質のスクリーニング系も予定通り確立できた．．
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| Strategy for Future Research Activity |
mCherry-EGFP-LC3Bを発現させた細胞に対し様々なオートファジー誘導剤とシグナル伝達阻害剤を共処理し，赤色の輝点を画像解析により定量することでオートファジーの誘導レベルを評価していく．その結果を階層的クラスリングによって網羅的に解析することで，がんと神経細胞におけるオートファジーの制御機構の違いを明らかにする．
SO286化合物についてはSOBPのSO286との結合部位の同定を行う．そのためにSOBPの様々なドメインの欠失変異タンパク質を大腸菌に発現させて，ビオチン標識したSO286との結合実験を行う．またSOBPはオートファジーとの関係が示唆されていることから，SOBPのノックダウン細胞でのオートファジーの効果，及びそれに対するSO286の影響を検討する．
オートファジー細胞死誘導物質探索については，実際に樹立した細胞を用いて標的が既知である化合物ライブラリーからのスクリーニングを行う．ヒットした化合物については細胞死の情報伝達経路を解析する．また新規化合物の取得を目指し，放線菌培養液からのスクリーニングも行う．ヒットサンプルが得られた場合は活性化合物の単離・精製，及び構造解析を行う．さらに様々な癌細胞を用いて既存の制癌剤との感受性細胞のパターンの違いを検証する．
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