2016 Fiscal Year Annual Research Report
多点光ラベル解析による膜タンパク質機能構造のモニタリング
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15H03119
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| Research Institution | University of Toyama |
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Principal Investigator |
友廣 岳則 富山大学, 大学院医学薬学研究部(薬学), 准教授 (70357581)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
千葉 順哉 富山大学, 大学院医学薬学研究部(薬学), 助教 (50436789)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 光アフィニティーラベル / 化学プローブ / プロテオミクス / 結合部位解析 / 分子認識 / 標的同定 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では従来光アフィニティーラベル法を刷新し解析効率を向上させることで、リガンド結合ポケットにおいて複数ラベル部位の同時解析を可能にする。これにより微量発現タンパク質同定に限らず、タンパク質－リガンド結合構造のモニタリングを可能とする光アフィニティー蛍光ラベル解析技術基盤を確立する。初年度の検討結果を受け、２年目は解析効率化のための微量ラベルタンパク質処理や反応基の改善を中心に進めた。以下、アロステリック酵素を用いたドメイン構造解析、プロテオームにおけるラベル解析効率の評価、多機能性反応ユニットの作製と最適化の開発項目別に記載する。
１．「グルタミン酸デヒドロゲナーゼ機能構造解析」 アロステリック調整部位に結合するATPプローブを用いてラベル解析を推進した。解析前処理操作の見直しを行い、さらに同位体を利用することで解析に必要な試料量の削減に成功し、主要ラベル以外の複数微小ラベルピークの解析に成功した。
２．「プロテオームにおけるラベル解析評価」 最も煩雑な膜タンパク質を対象にして、開発項目３で初年度に開発した高度濃縮用ビオチンタグを導入したプローブを用いてラベル解析を実施した。生細胞中の膨大な夾雑物存在下で極微量ラベルタンパク質を絞り込むための試料前処理条件を種々検討した結果、予備的ではあるがラベルペプチドを検出するまでに至った。
３．「多機能性反応ユニットの作製と最適化」 項目２で用いた反応基とは別に、濃縮タグをフェノール基に導入した反応基を作製したが不安定であり開発を断念した。初年度に開発した異なる切断機構を有する新規光反応基では、その誘導体を作製し反応性や物性を評価した結果、ラベルタンパク質の濃縮／選択的溶出に有用な光切断反応を光クロスリンク反応と明瞭に区別する条件を確立した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
最終目的は膜タンパク質に適応可能な高性能ラベル構造解析法の確立である。２年目は、反応基の改善を進め、プロテオミクスに対応した光反応基ユニットの機能付加、および初年度に開発した新規反応基の光反応制御に成功した。またラベル解析では諸条件の精査を行い、初年度に設定した評価系で複数の微量ラベルアミノ酸を同定し、複数ラベルの同時解析に成功した。また、生細胞を用いた解析効率評価では、細胞中の膨大な夾雑物存在下で極微量ラベルタンパク質を絞り込むための試料前処理条件を種々検討した結果、予備的ではあるが、膜画分から微量ラベルペプチドの解析に成功した。以上のことから最終目的に資する技術基盤に到達しつつある。
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| Strategy for Future Research Activity |
極微量ラベルアミノ酸が解析可能な効率化をプロテオーム評価系で実践しつつ、多点ラベル解析によるタンパク質機能ドメインの３次元的解析法を確立する。
１．アロステリック酵素を用いたドメイン構造解析
LC-MSでいくつかの蛍光ピークとラベル部位を対応させることに成功したが、引き続き、操作を改良しつつ更なる解析を進める。その最適条件で、各種機能制御物質や基質の存在下でのラベル部位を解析する。ラベルアミノ酸の変化からアロステリック機能と構造変化の相関をモニタリングする方法論を確立する。
２．多機能性反応ユニットの作製とプロテオームラベル解析効率の評価
引き続き、イオンチャネルやキナーゼを対象にした濃縮用タグを導入した光プローブにより、プロテオーム系でのラベル解析最適化検討を推進する。開発した新規光反応基についてはタンパク質ラベルを評価し、その結果を受けてライセート系での評価を進める。
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