2017 Fiscal Year Annual Research Report
Structural analysis of membrane protein based on multi-labeled sites
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15H03119
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| Research Institution | University of Toyama |
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Principal Investigator |
友廣 岳則 富山大学, 大学院医学薬学研究部(薬学), 教授 (70357581)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
千葉 順哉 富山大学, 大学院医学薬学研究部(薬学), 助教 (50436789)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 光アフィニティーラベル / 化学プローブ / 結合部位解析 / 分子認識 / 標的同定 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究ではリガンド結合ポケットの複数ラベル部位を同時解析することでタンパク質－リガンド結合構造をモニタリングする光アフィニティー蛍光ラベル解析技術基盤を確立する。最終年度は生細胞系ラベルを通して解析操作効率化を進めながら、多点ラベル解析によるタンパク質機能ドメインの３次元的解析法に展開した。以下、アロステリック酵素を用いたドメイン構造解析、プロテオームにおけるラベル解析効率の評価、多機能性反応ユニットの作製と最適化の開発項目別に記載する。
１．「グルタミン酸デヒドロゲナーゼ機能構造解析」 GDHアロステリック調整部位に結合するATPプローブを用いたラベル解析では、安定同位体による質量差を利用することで微小MSシグナルの判別効率向上に成功した。複数ラベルアミノ酸の位置情報と蛍光強度によるラベル量情報からGDH部分構造のダイナミックな動きを検出することに成功した。
２．「プロテオーム系でのラベル解析評価」 最も煩雑な系の膜タンパク質であるイオンチャネルを対象にして、ビオチンタグ導入型阻害剤プローブを用いた生細胞での微量ラベル解析を評価した。微量解析に必須である前処理条件の最適化を進めた結果、最近同定されたチャネル構成ユニットのファミリータンパク質など数種が検出されたが、一部はその機能解析に移行している。
３．「多機能性反応ユニットの作製と最適化」 本構造モニタリング技術をin situ解析など極微量系で展開するには、MS解析効率向上と共に、ラベル効率や蛍光特性の改善が必要であった。現反応基の機能化により切断効率の改善と微小MS同定効率の向上を達成した。一方、同様な機能を保持しつつ蛍光強度を100倍向上させた２種類の反応基開発に成功し、その１つはラベル収率も約10倍向上した。
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| Research Progress Status |
29年度が最終年度であるため、記入しない。
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| Strategy for Future Research Activity |
29年度が最終年度であるため、記入しない。
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