2015 Fiscal Year Annual Research Report
温度可変高速AFMの開発と温度依存的ATPaseの構造機能相関の解明
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15H03540
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| Research Institution | Kanazawa University |
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Principal Investigator |
内橋 貴之 金沢大学, 数物科学系, 教授 (30326300)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 一分子イメージング・ナノ計測 / 走査プローブ顕微鏡 / 蛋白質 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本年度は、室温から４５℃までの範囲で高速原子間力顕微鏡(AFM)の観察溶液を温度制御できるカンチレバーホルダーの開発を行った。カンチレバーホルダーの下部に位置するカンチレバー変位検出用レーザーの透過ガラスとして、ITO膜ガラスを用い、ITO膜への通電により昇温制御を行った。ITO膜ガラスへの通電が可能なように、ITOガラス両端への電極の設置とAFM本体との電気的絶縁が行えるような機構を製作し、温度計測のために熱電対をカンチレバーに設置した。また、高温での溶液の蒸発とそれによる温度変化を抑えるために、マイクロシリンジを用いた観察バッファの自動補填システムを導入した。これらにより室温～４５℃の温度範囲で±1℃の精度で連続的に温度を可変しながら高速AFM観察ができるようになった。当初懸念されたITO膜ガラスによる反射レーザー光量の低下は測定不可能になるほど顕著には見られなかった。高温側・温度制御高速AFMの動作確認を行うために、41℃に固-液相転移が起こり、膜の流動性が変化するDPPC脂質二重膜の高速AFM観察を行った。その結果、４１℃付近以上で脂質二重膜端面の形状が時間的に大きく揺動し、流動性が増している様子が観察できた。また、観察溶液の温度を上下させることにより、膜流動性は可逆的に変化することも確認できた。次に、六量体ATPaseであるFliIに適用し、酵素活性至適温度である38℃付近で単量体から六量体リングが形成していく過程を観察できた。これらの結果は高速AFMの温度制御観察の第一歩であり、高速AFMの応用範囲を大きく広げるものとして重要な成果である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当初計画通り、室温から４５℃の高温で温度制御可能な高速AFMを開発し、脂質膜の流動性変化の観察により動作確認も終えたため。
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| Strategy for Future Research Activity |
高温・高速AFM観察により、FliIのATP加水分解による構造変化を検出し、六量体リング内における酵素活性の協同性につい検証する。また、時計タンパク質KaiCとKaiAの相互作用の温度依存性を計測し、Kaiタンパク質による概日リズムの温度補償性に関する研究に応用する。室温以下４℃までの温度制御が可能なカンチレバーホルダーの設計と試作を行う。
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