2016 Fiscal Year Annual Research Report
electrochemical control of mas transfer and single cell analysis by multifunctional nanopipet
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15H03542
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| Research Institution | Tohoku University |
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Principal Investigator |
珠玖 仁 東北大学, 工学研究科, 教授 (10361164)
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2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 走査型プローブ顕微鏡 / １細胞分析 / 遺伝子発現 / 分化 / 液液界面 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
近年、１細胞分析が高感度化・ハイスループット化し、大腸癌患者の実組織試料を用いて、１細胞レベルでの網羅的遺伝子発現解析が報告されている。しかし現行法では、組織試料から1細胞分析を行う際には高性能セルソーターによる細胞分取が不可欠であり、組織試料の中での細胞個々の位置情報が失われてしまう点が問題であった。本研究では、走査型プローブ顕微鏡により組織モデルの高解像度画像を取得し、標的細胞から低侵襲的に極微量サンプルを高精度に回収して網羅的遺伝子発現解析をおこなう装置システムの開発を目的とする。
１．並列PCRと核酸タグ・インジェクション法：mRNAを捕捉する際に用いられるポリT配列プライマーに配列長100塩基分のインデックスを連結した核酸タグを合成し、１細胞ごとに蛍光色素と種類の異なる核酸タグを同時にインジェクションする系を検討した。電気化学シリンジの原理を応用し、水相と有機相を1本のピペット内に積層する方式（ミルフィーユ探針）により、インジェクションおよびmRNAの捕捉の作業効率向上を検討した。有機相の電解質濃度を最適化し操作の再現性を高めた。複数細胞種の同時遺伝子解析を実施した。ミルフィーユ探針内に複数種類の核酸タグが混在している場合でも、マーカー遺伝子の同時検出が可能であることを定量PCRにより確認した。
２．イメージングの最適化：2ch多機能ナノピペット探針を用い、高分解能SICM像を取得した後、指定したアドレスにおけるサンプルの微量回収が効率的に行えるよう回収工程を確立した。SICM画像は、水相チャネルのみならず、有機相チャネルのイオン電流をフィードバック信号に用いた場合でも取得可能であることが分かった。SICM用探針の電解質濃度や探針口径を変化させ、画像取得条件を検討した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
精製したRNAの代わりに細胞質に対して核酸タグを作用した場合にmRNA回収効率が低下した。ナノピペットを用いた核酸タグのインジェクションは、細胞回収と較べ操作条件が厳しいことが判明した。予定より多くの条件を最適化する必要が生じた。ナノピペット探針を駆動するための電気化学シリンジの基本原理や動作特性についても、電解質や核酸濃度の影響を考慮し幅広く条件を検討する必要が生じた。
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| Strategy for Future Research Activity |
電気化学シリンジを用いる実験系では、2ch多機能ナノピペット探針に加え、よりシンプルな系として1chの油/水界面ナノピペットプローブを使用することにより、基礎的な動作特性を詳細に取得することを検討する。蛍光分子を標識に用いて、試料への蛍光分子のインジェクションを確認する。電気化学シリンジを用いた遺伝子発現解析では、細胞を単層状に播種した場合と細胞塊を試料として実験系を構築する。細胞に対するダメージを減らすためにイオン分布やイオン電流の解析を検討する。サンプルリザーバーを設計・作製することにより、SPM画像取得時の任意の座標における細胞試料を回収しリザーバーの各アドレスに吐出する操作の自動化を検討する。多機能ナノピペットの応用例として、電気化学シリンジに加えて走査型電気化学顕微鏡-走査型イオンコンダクタンス顕微鏡(SECM-SICM)による形状、電気化学活性の同時画像化も検討する。
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[Journal Article] Three-dimensional co-culture of C2C12/PC12 cells improves skeletal muscle tissue formation and function2017
Author(s)
S. Ostrovidov, S. Ahadian, J. Ramon-Azcon, V. Hosseini, T. Fujie, P. P. Selvakumar, H. Shiku, T. Matsue. H. Kaji, M. Ramalingam, H. Bae, A. Khademhosseini*
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Journal Title
J. Tissue Eng. Reg. Med.
Volume: 11
Pages: 582-595
DOI
Peer Reviewed
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