2016 Fiscal Year Annual Research Report

Mechanistic Enzymology of Radical SAM Enzymes

Research Project

Project/Area Number	15H03834
Research Institution	Tokyo Institute of Technology
Principal Investigator	江口正東京工業大学, 理学院, 教授 (60201365)
Project Period (FY)	2015-04-01 – 2018-03-31
Keywords	ラジカルSAM酵素 / 生合成 / 反応機構
Outline of Annual Research Achievements	本年度では、まずアミノグリコシド抗生物質であるアプラマイシンの３’-デオキシ化に関わるラジカルSAM酵素の基質特異性について検討した。アプラマイシンは2-デオキシストレプタミン含有型アミノグリコシド抗生物質であり、C-3’位に水酸基を有さないのが特徴的である。これらの抗生物質の生合成遺伝子クラスター中のNADP+依存酸化還元酵素AprD3とラジカルSAM酵素AprD4が、C-3’位のデオキシ化反応に関与することが考えられたので、これら二つの酵素の組換えタンパク質を調製して種々の基質を用いて基質特異性を検討した。N-アセチルパロマミン、パロマミン、ネアミン、カナマイシンC、カナマイシンB、パロモマイシンの6種類の基質として、AprD3とApr D4による酵素反応を行なった結果、パロマミンとカナマイシンCを基質として用いたときに、生成物が観測された。以上より、AprD3, AprD4の基質の認識には基質のC-6'位が水酸基であることとC-2’位のアミノ基であることが重要であり、パロマミン部位を比較的厳密に認識していることが明らかとなった。また、抗生物質ホスホマイシンのC-メチル化に関わると考えられたラジカルSAM酵素のクローニング、発現に成功した。本酵素の発現では、通常の発現系では発現量が非常に少なかったが、発現系の詳細な検討により，酵素反応解析に十分な量の発現量を確保することが出来た。これらの結果を基に、C-メチル化反応における基質の調製、酵素反応生成物の標品の調製を行い、酵素反応を検討したところ、C-メチル化反応の活性を検出することが出来た。現在詳細な反応機構解析を行っている。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 本年度にて、アミノグリコシド抗生物質であるアプラマイシンの３’-デオキシ化に関わるラジカルSAM酵素の基質認識機構について明らかにした。さらに抗生物質ホスホマイシンのC-メチル化に関わると考えられたラジカルSAM酵素のクローニング、発現に成功し、そのC-メチル化活性の検出に成功した。さらにホスホマイシンの生合成全容を明らかにすべく、ホスホマシン遺伝子クラスターに含まれる酵素の機能解析に取り組んでいる。この様に、新たな知見が得られている段階にあり、これらを考えるとほぼ予定通りに研究計画が進んでいると考えられる。
Strategy for Future Research Activity	基本的には、本研究はおおむね順調に進展している。先にも述べたとおり、発現がうまくいかなかったことに対して、これまでの経験を通して、問題点を克服できている。今後は、さらに微生物二次代謝におけるラジカルSAM酵素のクローニング、発現、および酵素反応解析をさらに進めて、機能未解明のラジカルSAM酵素の機能解明を目指す。