2016 Fiscal Year Annual Research Report
癌治療用microRNAを内包した細胞膜透過性を有する人工ウイルス殻の創製
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15H03838
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| Research Institution | Tottori University |
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Principal Investigator |
松浦 和則 鳥取大学, 工学(系)研究科(研究院), 教授 (60283389)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
岩崎 崇 鳥取大学, 農学部, 准教授 (30585584)
三浦 典正 鳥取大学, 医学部, 准教授 (30325005)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 生体材料 / ペプチド / 自己集合 / マイクロRNA / 細胞透過性 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
beta-Annulusペプチドからなる人工ウイルスキャプシドへの分子内包挙動を検討し、蛍光性CdTe量子ドットおよびHis-tag GFPの内包にも成功した。また、表面にDNAを修飾した人工ウイルスキャプシドの創製にも成功した。昨年度合成に成功した細胞透過性His16ペプチドをC末端側に有するbeta-Annulusペプチド（40残基）は、HT1080細胞にある程度導入できることが明らかとなったが、複合体形成効率に問題があった。そこで、N末端にカチオン性のLys残基を有するHis16-beta-Annulusペプチドを合成し、その自己集合挙動および核酸との複合化を検討したが、数百nm程度の大きな集合体しか形成しなかった。また、N末端にジスルフィド結合を介して一本鎖DNAを連結したHis16-beta-Annulusペプチドの合成・精製に成功した。
また、His16修飾人工ウイルスキャプシドは、細胞膜透過した後にエンドソームにトラップされることがわかったため、エンドソーム崩壊ペプチドであるGALAペプチドをC末端に有するbeta-Annulusペプチドを調製し、His16ペプチドに加えてGALAペプチドを表出した人工ウイルスキャプシドを作出し、細胞膜透過ならびにエンドソーム脱出を評価した。しかし、His16とGALAペプチドを表出した人工ウイルスキャプシドは、細胞膜透過は示したものの、エンドソーム脱出を示すまでは至らなかった。
また、ヒトマイクロRNA（520d-5p）の標的遺伝子の絞り込みを行った。直接的標的遺伝子3種及び間接的標的遺伝子3種類に注目し、そのsiRNAを用いた併用導入により、in vivoでの520dの再現実験を行った。現在まで腫瘍非形成のみで再現を得られていないが、検討を続けている。また次世代シークエンスを行い、1塩基変異の野生型への変換の事態を確認した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
細胞透過性His16ペプチドを有するbeta-Annulusペプチドの合成ならびに蛍光ラベルDNAとの複合化に成功し、HT1080細胞にある程度取り込まれることが明らかになった。しかし、DNAの複合化率や細胞への取り込み効率、そしてエンドソーム脱出効率が十分ではない。今後、N末端にジスルフィド結合を介して一本鎖DNAを連結したHis16-beta-Annulusペプチドの自己集合により人工ウイルスキャプシドを創製し、その細胞内取り込み挙動を解析する。また、人工ウイルスキャプシドへの分子内包や表面修飾に関して、順調に成果が得られている。
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| Strategy for Future Research Activity |
N末端にジスルフィド結合を介して一本鎖DNAを連結したHis16-beta-Annulusペプチドの自己集合により人工ウイルスキャプシドを創製し、細胞内還元環境下での核酸の放出、細胞内取り込み挙動をCLSM観察およびFACSにより解析する。また、蛍光標識DNAの替わりにmicroRNAを内包したHis16修飾人工ウイルスキャプシドを自己集合により構築し、その水中での自己集合挙動評価ならびに、細胞膜透過性を評価する。さらに、人工ウイルスキャプシドに強力な膜融合ペプチド（具体的にはINF7やS19）を修飾することで、エンドソーム脱出能を補強した人工ウイルスキャプシドを創出する。
さらに、これをマウスに導入し、癌の正常化活性や毒性評価などを行う。科学論文報告の内容も勘案して、メカニズム解明のため対象遺伝子も新たに検討しつつ、520d-5pの再現を他の遺伝子で行う。
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