2015 Fiscal Year Annual Research Report
マイクロ流体フロー時分割赤外分光光度計の開発と酵素反応の短寿命中間体の解析
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15H03841
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| Research Institution | Institute of Physical and Chemical Research |
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Principal Investigator |
久保 稔 国立研究開発法人理化学研究所, 放射光科学総合研究センター, 専任研究員 (90392878)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 時間分解赤外分光 / マイクロ流路フローセル / 一酸化窒素還元酵素 / ポンププローブ法 / 蛋白質 / 超精密計測 / 高性能レーザー / 生物物理 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究の目的は、高輝度のフェムト秒赤外レーザーを光源に用いて、いまだ困難とされるフロー型の時間分解赤外分光装置を開発し、酵素反応の観測に応用することである。装置の第一の応用として、一酸化窒素還元酵素（NOR）の酵素反応を追跡し、国内外で論争中の反応機構に決着をつける。
本年度は、光で反応を誘起する「フロー・フラッシュシステム」を開発し、ケージドNOを用いて、NOR反応の時間分解観測を試みた。このシステムは、励起光照射と同期して未反応試料を20ナノリットルずつマイクロ流路フローセル（光路長20 μm）に送液可能であり、収量の少ない膜タンパク質にも応用可能である。エキシマーレーザー（308 nm, 8 ns）からのUVパルスを励起光に用いて、ケージドNOからのNO放出を誘起した。
NO還元反応は、活性部位である鉄二核中心（ヘム鉄と非ヘム鉄）に2分子のNOが配位することから始まる。NOの配位構造は反応機構を考える上で鍵となるが、NO結合型は短寿命であり実験的解析が困難なため、長年未解明であった。まず、励起光照射後500マイクロ秒の赤外スペクトルを測定した結果、反応生成物であるN2Oのバンドが観測され、ケージドNOを用いた反応系の有用性が確認された。次に、励起光照射後10マイクロ秒の赤外スペクトルを測定した結果、ヘム鉄に結合したNOのバンドと非ヘム鉄に結合したNOのバンドの2本が観測された。これはtrans型のNO配位構造（trans型反応機構）を支持しており、論争中の反応機構に決着をつける結果が得られた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
フロー・フラッシュシステムを完成させ、NORの反応機構解明にまで至ったため
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| Strategy for Future Research Activity |
NOとN2Oの赤外バンドの時間変化を追跡する。また、変異体を用いて反応速度を制御しながら、NN結合形成時に現れる不安定反応過渡種（hyponitrite）の観測を試みる。
一方、溶液混合システムを開発し、フロー型時間分解赤外分光装置の汎用化を目指す。
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[Journal Article] Molecular mechanism of the catalytic reaction of NO reductase revealed by novel time-resolved visible/IR absorption spectrometers with microfluidic device2016
Author(s)
Kimura, T., Takeda, H., Ishii, S., Tosha, T., Shiro, Y., Kubo, M.
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Journal Title
Biophysical Journal
Volume: 110 Supp1
Pages: 548a
DOI
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[Presentation] Molecular mechanism of the catalytic reaction of NO reductase revealed by novel time-resolved visible/IR absorption spectrometers with microfluidic device2016
Author(s)
Kimura, T., Takeda, H., Ishii, S., Tosha, T., Shiro, Y., Kubo, M.
Organizer
The 60th Biophysical Society Annual Meeting
Place of Presentation
Los Angeles Convention Center (Los Angeles, USA)
Year and Date
2016-03-02 – 2016-03-02
Int'l Joint Research
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[Presentation] Development of a highly-sensitive time-resolved IR spectrometer and its application to high-background aqueous biological samples2015
Author(s)
Kubo, M., Kimura, T., Yamaguchi, Y., Yanagisawa, S., Komiya, R., Yan, J., Nakashima, S., Ogura, T., Shiro, Y.
Organizer
Pacifichem 2015
Place of Presentation
Marriott Waikiki Beach (Hawaii, USA)
Year and Date
2015-12-18 – 2015-12-18
Int'l Joint Research
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[Presentation] Development of a time-resolved visible/IR absorption spectrometer with a novel microfluidic device and its application to catalytic reaction of NO reductase2015
Author(s)
Kimura, T., Ishii, S., Tosha, T., Shiro, Y., Kubo, M.
Organizer
Pacifichem 2015
Place of Presentation
Hawaii Convention Center (Hawaii, USA)
Year and Date
2015-12-16 – 2015-12-16
Int'l Joint Research
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