2016 Fiscal Year Annual Research Report
液体メニスカスによる卵膜保護が可能とする魚卵の冷凍保存の実現
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15H03933
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| Research Institution | Kyushu Institute of Technology |
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Principal Investigator |
鶴田 隆治 九州工業大学, 大学院工学研究院, 教授 (30172068)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
谷川 洋文 九州工業大学, 大学院工学研究院, 助教 (80197524)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 凍結保存 / 魚卵 / 液体メニスカス / 脱水冷凍 / 凍害防御剤 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
実現困難とされている魚卵の凍結保存を可能とすべく，卵膜の親水性を利用した液体メニスカスと事前の脱水の脱水処理を組み合わせた新たな凍結保存法を提案する．メニスカス溶液にはトレハロース水溶液などの細胞膜保護物質を用い，凍結前に常温での脱水処理をあわせて施すことにより,魚卵内外での氷晶生成による機械的ストレスを抑制することが狙いである．現時点では，メニスカス凍結，すなわち外部溶液凍結時までは卵の生存が確認できているが，卵内凍結まで行った場合に，解凍後での生存は確認できていない．したがって，卵内凍結による損傷を改善するために，魚卵内に凍害防御剤を導入する必要であり，その可能性を追求することが課題と考えている．
平成28年度は，魚卵としてメダカ卵を選定し，細胞膜透過型凍害防御剤の導入効果の検証とマイクロマニピュレータを用いたガラスキャピラリーによる新たな穿孔法を検討した．
まず，卵内に凍害防御剤を導入するために，分子量の小さいグリセリンを含んだ水溶液に卵を浸漬させる膜透過導入方法を試みた．これにより，凝固点降下や凝固潜熱の低下などの現象から，凍害防御剤であるグリセリンは卵内に導入されていると考えられる．しかしながら，どれくらいの浸漬時間で卵内に導入されているのか，凍害防御剤の注入量などが今後検証すべき課題と考えている．
次に卵内への直接的な凍害防御剤の注入方法として，マイクロマニピュレータを用いたガラスキャピラリーによる新たな穿孔法を検討した．液体メニスカスを応用し，-3℃での植氷による液膜凍結後に，-3℃の状態を10分間程度維持し，卵膜も凍結させた後に針の挿入を行うことで，比較的容易に針を卵に挿入することができた．また，針を挿入する際に卵の形状が保たれていることからも，液体メニスカスの新たな有効性を確認することができた．実際の凍害防御剤の注入及びその影響の検討は次年度に行うこととした．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究課題の目標は，メダカ卵の凍結保存を実現することであるが，現時点ではメニスカス凍結すなわち外部溶液凍結まででは卵の生存は確認できているものの，卵内凍結後の生存は確認できていない．したがって，卵内凍結時の氷晶成長による損傷を改善するために，卵内に凍害防御剤を導入することが課題と考えている．
平成28年度では，グリセリン水溶液に卵を浸漬することによる細胞膜透過型凍害防御剤の導入効果の検証と，マイクロマニピュレータを用いたガラスキャピラリーによる新たな穿孔法を検討した．
まず，卵をグリセリン水溶液に浸漬後，示差走査熱量計を用いて，凍結・解凍までの操作を行ったところ，卵内凍結温度の低下や凝固潜熱の減少が観測された．また，卵内氷晶形成状況を顕微鏡観察したところ，グリセリン浸漬後の卵は凍結後に光の透過性が減少したことから，氷晶は微細であったと考えられる．この結果により，凍害防御剤であるグリセリンは卵内に導入されていることが確認できた．しかし，解凍後での卵の生存が確認できておらず，卵内凍結を改善するためには，やはり直接的な凍害防御剤の注入が必要と考える．
なお，卵内への直接的な凍害防御剤の注入には，マイクロマニピュレータを用いたガラスキャピラリーによる操作があるが，メニスカスがない状態で針を挿入しようとすると，弾力のある卵膜によって針の押し付け面が凹むだけで上手く刺さらない．そこで，液体メニスカスを応用し，-3℃での植氷による液膜凍結後に，-3℃の状態を10分間程度維持し，卵膜を凍結させた後に針の挿入を行うことにより，比較的容易に針を卵に挿入することができた．また，針を挿入する際に卵の形状が保たれていることからも，液体メニスカスの新たな有効性を確認することができた．今後は実際に卵内への凍害防御剤の注入を行い，その効果を検証する必要があると考えられる．
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| Strategy for Future Research Activity |
平成28年度に，凍結前の卵をグリセリン水溶液による浸漬処理を行うことにより，卵内に凍害防御剤であるグリセリンを導入できることを確認した．また，直接的な凍害防御剤の注入方法として，液体メニスカスと卵膜を凍結させた後にガラスキャピラリーによる穿孔を行う方法が有効であることを確認した．
そこで，平成29年度は，卵内凍結時の氷晶成長を抑制することに本格的に取り組む．まず浸漬処理によるグリセリン導入量の推定を行う．具体的には，各濃度のグリセリンにおける凍結時の温度と未処理の卵の凍結時の温度差からモル濃度を算出する．また，最適な浸漬処理時間も推定する．この浸漬処理時間を変え，凍結温度を測定することにより，どの程度の浸漬時間で卵内にグリセリンが導入されているのかを調べる．
ガラスキャピラリーによる注入方法では，まず，キャピラリーによる穿孔のみを行い，その後の孵化率を調べ，卵膜に損傷を与えても影響がないことを立証する．その上で，卵内にグリセリンなどの凍害防御剤を実際に導入し，孵化にどのような影響があるのかを調べる．また，定量的に注入を行うのは困難であると考えられるが，先ほどと同様に凝固点降下から注入量を推定する．その注入量による卵内凍結挙動の変化を調べるため，顕微鏡観察を通して，氷晶サイズと損傷の関連を，冷却速度などを評価して実施する．
また，昨年度は解凍操作の影響まで調査することはできなかったが，ミジンコなどの他生物の凍結保存において，解凍速度を速くすることで凍結保存に成功しているという情報も得ている．現在は凍結後に空気中で5℃/min解凍しているが，今後はそれよりも速い速度で解凍を行い，研究の最終目標である魚卵の凍結保存の成功に結び付けたいと考えている．
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Research Products
(1 results)
