2016 Fiscal Year Annual Research Report
Development of innovative immunoassay through the application of quench-release principle to natural antibodies
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15H04191
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| Research Institution | Tokyo Institute of Technology |
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Principal Investigator |
上田 宏 東京工業大学, 科学技術創成研究院, 教授 (60232758)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
董 金華 東京工業大学, 科学技術創成研究院, 助教 (80527838)
大室 有紀 (松山有紀) 東京工業大学, 科学技術創成研究院, 助教 (30571088)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | バイオテクノロジー / タンパク質 / 免疫学 / プロテオーム / バイオセンサー / 蛍光 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
1. 抗体タンパク質のQ-body化に関する検討 本研究において我々は，サンプルと混ぜて蛍光強度を測定するだけで各種抗原を高感度に検出可能な蛍光免疫測定素子Q-bodyを，従来よりも簡便かつ迅速に構築する方法の開発と，こうして作製したQ-bodyの多項目同時解析への応用を目指している。
本年度は従来の蛍光標識法と異なる3種類の蛍光標識法の確立を試みた。最初に，アミノ基転移反応を利用したN末端ケトン化による組み換えFab断片のQ-body化に関する論文をまとめ，続いて，抗体可変領域内部に存在する芳香族アミノ酸からなる核酸結合部位(Nucleotide binding site, NBS)に親和性を持つインドール酪酸とTAMRA色素からなるプローブを紫外線照射によりクロスリンクする方法により，抗ヒト血清アルブミン(HSA) IgGを蛍光標識することに成功し，HSA依存的な蛍光応答を得た。また修飾プローブをペプチド合成法で作製することで側鎖に電荷を導入して抗体との親和性を向上させ，修飾効率を向上させる検討を開始した。
また新たに，最近発見された抗体L鎖結合タンパク質Protein Mを用いた蛍光プローブを用いて，抗体と混合するだけでQ-body化できる技術を構築した。
2. Q-bodyの細胞イメージングへの応用 27年度に成功した，がん細胞に過剰発現するHER2タンパク質検出の成果を発展させ，28年度はQ-bodyによるがん治療を試みた。Her2認識Fab型Q-bodyのＣ末に9xArg配列を付加し，これにPolo-like kinase (Plk1)に対するsiRNAを作製したところ，洗浄操作なしでHER2陽性細胞のみを30分以内に蛍光染色することに成功したのみならず，３日間の培養後，HER2陽性細胞にてPlk1タンパク質の顕著な発現抑制と50%以上の細胞死誘導を確認した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
1.抗体タンパク質のQ-body化に関する検討 N末標識法においてはこれを論文化した。光架橋法においてはこれまで標識率・応答性とも従来法によるQ-bodyより低い値しか得られず，この改良法検討に少し時間を要したが，プローブ構造をペプチド骨格とすることで抗体との親和性を向上できる見込みがでてきた。また，抗体Ｌ鎖結合タンパク質Protein Mを蛍光修飾することで，抗体と混合するだけでQ-bodyを構築する技術を新規に構築した。
2. Q-bodyの細胞イメージングへの応用 Q-bodyをがんの診断のみならず，siRNAとの複合化によりがん治療にも応用できる，という予想以上の結果を得ることが出来た。
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| Strategy for Future Research Activity |
1.抗体タンパク質のQ-body化に関する検討においては来年度以降も各プローブの構造と反応条件等について，条件検討を行う 。
2. Q-bodyの細胞イメージングへの応用においては，二つの細胞膜抗原で原理的証明ができた。今後はさらにQ-bodyの利点が最大限に生かせる，p53などの細胞内抗原検出系について検討する。
3. 診断用プロテインチップの構築 入手可能な抗体産生細胞，ならびにその産物を用いて，Q-bodyのレパートリーを広げていく。その際，Protein Mを用いて，Q-body化に適した抗体を選別できる系を構築する。
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