2017 Fiscal Year Annual Research Report
Mechanism of PKD activation for monoamine release
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15H04276
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| Research Institution | Nagoya City University |
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Principal Investigator |
白根 道子 名古屋市立大学, 大学院薬学研究科, 教授 (90398082)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | モノアミン |
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| Outline of Annual Research Achievements |
モノアミンはヒトの精神活動や運動機能を制御する神経伝達物質だが、その分泌にはトランスゴルジネットワーク（TGN）からの輸送小胞の形成機構が関与している。TGN における輸送小胞形成過程ではprotein kinase D (PKD)が重要な役割を果たしているが、モノアミン分泌におけるPKD の関与は知られていなかった。われわれはプロトルーディンによる輸送制御と膜構造調節への関与を明らかにしたが、さらにPKD 活性制御とモノアミン分泌への関与を見いだした。しかしその詳細な機構は不明であるため、本研究でその解明を目指した。TGN 局在のプロトルーディン結合タンパク質としてPDZD8 とTMEM55 を新規に同定した、本研究で、それらによるPKD 活性制御と膜曲率制御について解析し、TGN におけるモノアミン分泌小胞形成の制御機構を調べた。
PKD のリン酸化と活性化を並行して調べ、PKD の活性化機構に繋げる試みをした。PKD リン酸化状態を評価するために、Ser744/Ser748 およびSer916 のリン酸化抗体を用いたWestern blotting を行った。また、PKD活性化状態を評価するために、既知のPKD 基質のリン酸化抗体を用いたWestern blotting を行った。
TGN における分泌小胞の形成能を評価するために、イメージング解析によるTGN および小胞の形態観察を行った。電子顕微鏡によるTGN の形態観察や、TGN マーカータンパク質(TGN38 など)の免疫染色による蛍光顕微鏡解析を行った。
分泌物質の定量解析を行った。分泌細胞として、PC12 細胞やマウス初代神経培養細胞を用いた。PC12 細胞は、ドーパミンなどのモノアミンや、クロモグラニンなどの分泌性タンパク質をNGF 依存的に分泌するため、シグナル依存的な分泌の解析に有用である。培養上清中の分泌物質の定量解析を、モノアミンや神経ペプチドについてはELISAにより、また
分泌性タンパク質についてはWestern blotting により解析した。
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| Research Progress Status |
29年度が最終年度であるため、記入しない。
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| Strategy for Future Research Activity |
29年度が最終年度であるため、記入しない。
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