2016 Fiscal Year Annual Research Report
エクソソーム解析系に基づく造血器腫瘍の新規診断法の開発
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15H04303
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| Research Institution | Tokyo Medical University |
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Principal Investigator |
大屋敷 一馬 東京医科大学, 医学部, 主任教授 (20201387)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
大屋敷 純子 東京医科大学, 医学部, 教授 (20191950)
梅津 知宏 東京医科大学, 医学部, 講師 (40385547)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | miRNA / エクソソーム / 骨髄異形成症候群 / 骨髄間質細胞 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、造血器腫瘍における骨髄内での腫瘍細胞と周辺細胞である骨髄間質細胞との細胞間コミュニケーション機構の解明を目的として、骨髄異形成症候群（MDS）患者由来骨髄間質細胞より分泌されるエクソソームの疾患特異的miRNAの同定と、患者末梢血中のcell free分画より単離したエクソソームの疾患特異的miRNAの同定を行う。
初年度（H27年度）では骨髄内で腫瘍細胞の発育・進展に関与している骨髄間質細胞の培養系および骨髄間質細胞由来エクソソームの解析モデル系を構築した。次年度（H28年度）ではtraining cohortとして文書（IRB承認No. 2648）にて同意を得たMDS患者（low-risk群: 10例、high-risk群：10例）由来の骨髄間質細胞が放出するエクソソームを回収し、TaqMan miRNA arrayを用いてexosomal miRNAの半網羅的解析を行った。その結果、miR-Xを含むhigh-risk群の骨髄間質細胞で特異的に発現が変化するexosomal miRNA群を見出した。これらの候補miRNAに対してmiRTarBaseを用いたバイオインフォマティクス解析によって標的遺伝子を探索し、miR-XがEZH2やDNMT3Aなどのエピジェネティク制御因子をターゲットとしていることが示唆された。
さらに、骨髄間質細胞が放出したエクソソームの一部は患者血漿中に遊離して末梢血中にも存在すると仮定し、MDS患者血漿サンプルを用いて解析を行った。Training cohortとして健常者10名、MDS患者20名（low-risk群: 10名、high-risk群: 10名）の血漿からエクソソーム分画を単離し、miR-Xについて個別PCRを用いて解析すると、骨髄間質細胞由来エクソソームに内包されるmiRNAの発現パターンとは相反する発現パターンを示した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究では、造血器腫瘍における骨髄内でのエクソソームの細胞間コミュニケーション機構を解明すると同時に、純化したエクソソームにより疾患関連miRNAを次世代シーケンサーなどのハイスループットなシステムを用いて網羅的に解析を行うと計画した。そして、造血器腫瘍における病勢診断や治療法確定のための新規のエクソソーム診断法の確立を目指した。初年度、次年度では疾患特異的exosomal miRNAを同定することを目的とし、研究協力者と連携してMDS患者由来骨髄間質細胞ライブラリーの構築を継続している。当初の研究計画では、これらの患者由来骨髄間質細胞が放出するエクソソームから、次世代シーケンサーシステムを用いた機能未知も含むmiRNAの網羅的探索を予定していたが、現時点においても現有設備（イルミナMiSeq）のRNAseq用解析アプリケーションのサポートが不十分であり、TaqMan PCR arrayでの半網羅的解析による手法を選択した。TaqMan PCR arrayによる解析は当研究室でもこれまでに数多くの成果を見出しており、データ抽出から候補miRNAのターゲット探索までのフローが確立しており、当初の研究計画の目的であるmiR-Xの同定を達成できた。
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| Strategy for Future Research Activity |
最終年度であるH29年度は、H28年度に見出したhigh-risk群のMDS患者由来骨髄間質細胞で特異的に発現が変化するexosomal miRNAについて、強制発現系や改変エクソソームを用いた共培養系を用いた機能解析を行う予定である。また、骨髄間質細胞由来エクソソーム内でのmiRNAの発現パターンと、患者血漿中のcell-free分画に存在するmiRNAの発現パターン変化の生物学的意義を明らかにするため、in vitroモデル解析系の構築を行う。
一方、骨髄間質由来エクソソームの解析で抽出された候補miRNA群と、training cohortの患者血漿から抽出された候補miRNA群において共通するmiRNAについてvaridation cohortでの解析へと進め、病型別の変化、白血病への進展の有無などの病勢との関係について検討する。
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