2015 Fiscal Year Annual Research Report
高機能型低分子二重特異性抗体への革新的がん特異的構造変換デザイン
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15H04306
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| Research Institution | Tokyo University of Agriculture and Technology |
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Principal Investigator |
浅野 竜太郎 東京農工大学, 工学(系)研究科(研究院), 准教授 (80323103)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
古本 祥三 東北大学, サイクロトロン・ラジオアイソトープセンター, 教授 (00375198)
真壁 幸樹 山形大学, 理工学研究科, 准教授 (20508072)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 蛋白質 / 癌 / バイオテクノロジー |
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| Outline of Annual Research Achievements |
がん細胞とリンパ球間の架橋による強力な治療効果と、高いがん組織への浸透性を兼ね備えた低分子二重特異性抗体は魅力的な人工抗体である。本研究では、がんで更新しているプロテアーゼの認識配列を用いることで、がん特異的な高機能型への構造変換デザインを目指している。
diabody型低分子二重特異性抗体Ex3をモデルに、まずプロテアーゼの認識配列のリンカーへの挿入、および切断による構造的自由度の向上の有無を検証するため、GSTタグにより酵素そのものの除去が容易なPreSicssion Proteaseの認識配列の挿入を行った。Ex3はリンカー配列を2つ含むため、それぞれに挿入した分子を作製し、大腸菌発現系により調製後、機能評価へと進めた。結果、興味深いことにプロテアーゼの認識配列を挿入することで、挿入前に比べがん細胞傷害活性が向上することが明らかになった。これは、細胞間架橋に於いてより有利な結合角度を有することができたためと考えられるが、一方で実際にPreSicssion Proteaseでリンカーを切断したところ、期待するような自由度の向上に伴う活性の向上は見られなかった。しかしながらリンカー改変の意義は認められたため、Matrix metalloproteinase-2(MMP-2)やMMP-9など実際に多くのがん細胞で亢進しているプロテアーゼの認識配列を導入したEx3の作製へと進めた。文献等を参考に、候補配列を4種類選定し、同様にEx3の2つのリンカー配列に挿入した分子を計8種類デザインし、それぞれ発現ベクターを構築した。今後詳細な機能評価へと進める予定である。一方、新規低分子二重特異性抗体の網羅的な作製を効率的に行うためには、形態と活性に関して学術的に理解する必要があるため、Ex3とは異なる抗EGFR抗体を用いた低分子二重特異性抗体の機能評価も合わせて進めた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
diabody型低分子二重特異性抗体Ex3をモデルに、まずプロテアーゼの認識配列のリンカーへの挿入、および切断による構造的自由度の向上の有無を検証するため、市販のプロテアーゼの認識配列の挿入を行ったところ、興味深いことに活性の向上が認められる一方で、期待するような自由度の向上に伴う活性の向上は見られなかった。しかしながらリンカー改変による機能向上の可能性、およびプロテアーゼの認識配列のリンカーへの挿入方法が適していなかった可能性を考え、本来の目的であるがん細胞で亢進しているプロテアーゼの認識配列を導入したEx3の作製へと進めた。MMP-2およびMMP-9によって認識されるプロテアーゼの認識配列を選定すると共に、よりリンカー部位でのフレキシビリティを向上させるため、両端に構造的自由度の高いアミノ酸をさらに付加したリンカーを、計8種類デザインし、それぞれ大腸菌用発現ベクターを作製した。以上の様に、当初予想されたものとは異なる結果が得られ、また進捗に応じて少し修正しているものの、研究全体としては大きな遅れは生じていないためおおむね順調に進展しているとした。
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| Strategy for Future Research Activity |
前年度に引き続き、diabody型低分子二重特異性抗体Ex3をモデルに、がん細胞特異的に高活性型へと構造変換する新規デザインの開発を目指す。今年度作製したがん細胞で亢進しているプロテアーゼの認識配列をリンカーに挿入した大腸菌用発現ベクターを用いて発現、調製後、機能評価へと進める。がん細胞傷害性試験では、市販のMMPを用いて事前に切断したEx3から検討を進め、最終的には使用する各がん細胞株のMMPの発現状況を調査後、未切断のまま添加し高活性型へのがん特異的構造変換による活性の向上を評価する。また半減期の長い高分子量型から高浸透型へ、すなわち高分子量型から低分子量型へのがん特異的な構造変換デザインも平行して進める。Fc融合Ex3をモデルに、同様にがん細胞で亢進しているプロテアーゼの認識配列のFc融合部位への導入を目指す。動物細胞発現ベクターを作製後、CHO細胞に遺伝子導入を行い、抗生剤によるスクリーニング後、安定産生株を樹立する。 Db型Ex3のデザインと同様に市販のMMPを用いてまず期待通りに切断されるかを確認後、がん細胞近傍で実際に高分子量型から低分子量型への変換が行われるかの評価を進める。
一方、新規低分子二重特異性抗体の網羅的な作製に向けても、引き続き、新たなDb型低分子二重特異性抗体の作製や配向性の改変と併せて研究を進め、次年度は特に親和性との関係を簡易モデリングの結果も踏まえて考察することで、より高機能な革新的がん治療抗体の開発を進める。
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