2016 Fiscal Year Annual Research Report
卵巣癌における抗ＶＥＧF抗体療法感受性・耐性機序の解明
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15H04309
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
越山 雅文 京都大学, 医学研究科, 客員研究員 (50724390)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
松村 謙臣 京都大学, 医学研究科, 准教授 (20452336)
馬場 長 京都大学, 医学研究科, 講師 (60508240)
濱西 潤三 京都大学, 医学研究科, 講師 (80378736)
小西 郁生 京都大学, 医学研究科, 名誉教授 (90192062)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 抗VEGF抗体治療 / Gr-1陽性細胞 / CD8陽性リンパ球 / 骨髄由来免疫抑制性細胞 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
進行卵巣癌に対する抗VEGF抗体（ベバシツマブ）が2013年以降保険適応となり、臨床応用されるようになってきたが、治療抵抗性に再発あるいは進展する症例も少なからず存在することが分かってきている。
抗VEGF抗体耐性のメカニズムの解明は卵巣癌治療における至上命題と考えられる。我々は、マウス卵巣癌細胞株であるHM-1B6C3F1マウスに接種しマウスモデルを作成し、抗マウスVEGF抗体（B20-4.1.1）で治療を行った場合、治療抵抗性に腫瘍が増大することを確認した。さらに、抗VEGF抗体治療抵抗性の腫瘍では明らかにGr-1陽性細胞が増加し、CD8陽性リンパ球が減少していることを見出した。Gr-1陽性細胞は、骨髄由来免疫抑制性細胞(Myeloid-derived suppressor cells)であることが知られており、抗VEGF抗体治療抵抗性にはGr-1陽性MDSCの浸潤による免疫抑制が関与していると考えられた。そこで、Gr-1陽性細胞の誘導を促進する機序の解明、そしてその標的治療が抗VEGF抗体治療抵抗性を克服できると考え実験を行った。また、抗VEGF抗体治療後の腫瘍はCD31+内皮細胞が減少しており、腫瘍血管新生を阻害することによる腫瘍低酸素環境がGr-1陽性MDSCの浸潤に関与している可能性が考えられた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
抗VEGF抗体耐性腫瘍からRNAを抽出し、MTA-1.0 (Affymetrix社)によるトランスクリプトーム解析を行い、ssGSEAに基づくパスウェイ解析を行ったところ、抗VEGF抗体投与群ではRatIgG投与コントロール群と比較し、NFkB経路やHIF1a低酸素関連経路が有意に亢進していた。ピモニダゾールを用いて免疫染色を行うと、抗VEGF抗体抵抗性腫瘍で有意に低酸素領域が増加、さらに免疫蛍光染色ではGr-1陽性細胞が低酸素領域に集簇していることが観察され、腫瘍における低酸素環境がMDSCの誘導に関連していることが強く示唆された。腫瘍ライセートを用いた、サイトカインアレイを行ったところ、抗VEGF抗体抵抗性腫瘍で最も発現変動が大きい因子としてGM-CSFが同定された。In vitroでHM-1細胞株を低酸素環境下で培養を行ったところ、GM-CSFは低酸素環境下で発現が亢進することが、q-PCR、ウェスタンブロッティングを用いて示された。さらに、低酸素環境にあるHM-1細胞株ではNFkBの核移行が確認でき、低酸素環境下でNFkBシグナルが活性化していることが分かった。低酸素培養下のHM-1細胞に対し、si-RNAを用いてNFkBのノックダウンを行ったところ、GM-CSFの発現が減少することが確認でき、低酸素環境におけるGM-CSFの発現亢進はNFkBシグナルを介していることが分かった。そこで、抗VEGF抗体と抗GM-CSF抗体を併用し、HM-1マウス卵巣癌モデルの治療実験を行ったところ、抗VEGF抗体単独群に比べ、併用療法を行った群において有意に腫瘍縮小効果が認められることが分かった。
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| Strategy for Future Research Activity |
抗GM-CSF抗体との併用治療を行った腫瘍をサンプリングし、フローサイトメトリーを行ったところ、CD11b+Gr1+MDSCは有意に減少し、CD8陽性リンパ球が有意に増加していた。抗GM-CSF抗体を併用することで、腫瘍免疫環境が改善したことが腫瘍効果につながったと考えられる。今後は、マウス骨髄由来細胞を用いたMDSC産生実験の手法を用いて、GM-CSFがMDSCの機能に与える影響を解析する予定である。また、腫瘍由来のGM-CSFの分泌が腫瘍進展に促進するのかどうかを調べるために、HM-1にけるGM-CSFをノックダウンした細胞を樹立し、抗VEGF抗体による治療実験を行うことを計画している。また、GM-CSFは元来、骨髄細胞の分化に関わる事が報告されており、抗GM-CSF抗体を用いた場合、腫瘍局所だけでなく、脾臓における免疫細胞分画の変化について詳細に解析する予定である。
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