2016 Fiscal Year Annual Research Report
Identification and characterization of interactions between genomic regions using the locus-specific chromatin immunoprecipitation technology
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15H04329
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
藤井 穂高 大阪大学, 微生物病研究所, 准教授 (30302665)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
藤田 敏次 大阪大学, 微生物病研究所, 助教 (10550030)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | クロマチン / エピジェネティクス / ゲノム領域間相互作用 / ゲノム生化学 / 次世代シークエンス法 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
当該年度には以下の研究を行った。
1. βグロビン遺伝子座5'HS5領域と相互作用するゲノム領域の同定とその意義の解析
enChIP法を利用して、K562細胞のNaBによる分化誘導系を用いて、βグロビン遺伝子座5’HS5領域と恒常的あるいはNaBによる分化誘導に伴って相互作用する多数のゲノム領域を同定することに成功した。これらの相互作用ゲノム領域は、5’HS5領域と同一染色体上にあるもの (intra-chromosomal interactions) と異なる染色体上にあるもの (inter-chromosomal interactions) を含んでいた。ゲノム領域間相互作用を、独自に開発したDetection of DNA-DNA interactions (D-Cube) 法により確認した。Real-time RT-PCR法を用いて、5'HS5領域と相互作用しているゲノム領域近傍の遺伝子発現を解析したところ、NaBによる分化誘導に伴って発現が誘導されていることが分かった。このことから、NaBによる分化誘導に伴う5'HS5領域との相互作用が、遺伝子発現誘導に関与していることが示唆された。これらの結果をGenes to Cells誌に発表する（2017年3月31日現在で印刷中）。
2. インターフェロン誘導性遺伝子群の核内における動的制御機構の解析
これまでに作製した異なる種由来のタグ付きdCas9に加えて、3xFLAGタグを付与したS. aureus由来のdCas9 (Sa-dCas9-3xFLAG) の発現プラスミドも作製した。Sa-dCas9-3xFLAGを利用したenChIPの効率が、Sp-dCas9と同等であることを示した。現在、AMタグを付与したSp-dCas9との組み合わせで、sequential enChIP解析を行っている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
1. βグロビン遺伝子座5'HS5領域と相互作用するゲノム領域の同定とその意義の解析
5’HS5領域と相互作用しているゲノム領域を決定し、5'HS5領域と相互作用しているゲノム領域近傍の遺伝子発現が細胞分化に伴って誘導されることも示した。これらの結果をGenes to Cells誌に発表する（2017年3月31日現在で印刷中）。
2. インターフェロン誘導性遺伝子群の核内における動的制御機構の解析
Sequential enChIP解析のための高効率系を作成した。
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| Strategy for Future Research Activity |
1. βグロビン遺伝子座5'HS5領域と相互作用するゲノム領域の同定とその意義の解析
前年度までに、βグロビン遺伝子座5’HS5領域と相互作用するゲノム領域の網羅的同定に成功し、その成果をGenes to Cells誌に発表する。特に、相互作用しているゲノム領域近傍の遺伝子発現が、NaB処理により亢進することを見出した。本年度は、こうした現象の分子機構を解明するため、5’HS5インスレーターに結合している蛋白質及びRNAを網羅的に同定する。さらに、shRNAを用いたノックダウン法やCRISPR系によるノックアウト法を用いたloss-of-function実験によって、同定した分子をノックダウンし、それらの分子がゲノム間相互作用やNaB誘導性遺伝子発現に果たす役割を解析する。
2. インターフェロン誘導性遺伝子群の核内における動的制御機構の解析
PAタグを付与したS. thermophilus 由来のdCas9 (PA-dCas9 (ST)) と、3xFLAGタグを付与したS. pyogenes由来の dCas9 (3xFLAG-dCas9 (SP)) を用いたsequential enChIP法によって、恒常的あるいはIFNγ刺激に伴って、IRF-1遺伝子座と相互作用するゲノム領域を解析した。その結果、PA-dCas9 (ST)を用いたenChIP効率が低いことが判明した。そこで、新たに、3xFLAGタグを付与したS. aureus由来のdCas9 (Sa-dCas9-3xFLAG) の発現プラスミドも作製し、Sa-dCas9-3xFLAGを利用したenChIPの効率が、Sp-dCas9と同等であることを示した。本年度は、AMタグを付与したSp-dCas9との組み合わせで、sequential enChIP解析を行い、恒常的あるいはIFNγ刺激に伴って、IRF-1遺伝子座と相互作用するゲノム領域を網羅的に同定する。バイオインフォーマティクス解析により、相互作用ゲノム領域の類別や結合領域の特徴を解析し、どのような機能領域との結合が存在するのかを明らかにする。
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