2015 Fiscal Year Annual Research Report
Cys-tRNAの二段階合成反応を触媒する酵素複合体の分子機構解明
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15H04334
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| Research Institution | Hokkaido University |
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Principal Investigator |
田中 勲 北海道大学, 先端生命科学研究科(研究院), 特任教授 (70093052)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
姚 閔 北海道大学, 先端生命科学研究科(研究院), 教授 (40311518)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | X線結晶構造解析 / tRNA修飾 / アミノアシル合成酵素 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
古細菌におけるCys-tRNA(Cys)生合成経路は，tRNAにアミノ酸を直接付加する通常の一段階の反応ではなく，２つの酵素（SepRS, SepCysS）が触媒する二段階の反応から成り立っている．近年，研究代表者らは，この反応経路に必須の第３のタンパク質SepCysEを同定し，SepCysEを含めた3者複合体（Transsulfursomeと命名）が反応の機能単位であることを明らかにした．本研究では，そのTranssulfursomeとtRNA複合体のＸ線結晶構造解析を行い，構造をもとに二段階の反応から成るアミノアシル化反応の分子機構を解明し，それを通して生命進化の謎に迫ることを研究の目的としている．計画に基づき，平成２７度には以下の３点について研究を実施した．
○SepRS, SepCysS及びSepCysEとtRNACysの結合親和性・化学量論比の解析．それぞれの成分を精製した後，ネイティブPAGEおよびSECにより，SepCysE-SepCysSとtRNACysとは 2:1 で結合することを明らかにした．またITCの測定により，SepCysE-SepCysS複合体では, tRNACysの結合に対してSepCysEのCTDが重要な役割を果たしていることを明らかにした．
○TranssulfursomeおよびTranssulfursome-tRNACys複合体の構造解析．結合親和性・化学量論比解析の結果に基づいて，さまざまな複合体をデザインして結晶化を試みた．その結果，２種の複合体の結晶化に成功し，Ｘ線結晶構造解析を行った．
○小角X線散乱（SAXS）によるTranssulfursomeとtRNACys会合体の溶液状態の解析．放射光施設SPring-8とPFにてSAXS実験を行った．Ｘ線結晶構造解析の結果を利用して，そのデータを解析した．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
初年度の計画を順調に実行し，２種の複合体の結晶化と構造解析に成功した．
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| Strategy for Future Research Activity |
平成２７年度に実施した複合体の結晶構造解析より，SepCysEは２つのリンカーで分断された３つの構造単位から成り立っており，全体として，N-helix : linker1 : NTD : linker2 : CTDという構造をしていることが明らかになった．N-helixとNTDは，どちらも２量体として，それぞれ，SepRS，SepCysSに結合し，またCTDはtRNAに結合する．したがって，SepCysEは，N-helixとNTD を利用して，SepRS,SepCysSを結合させ，CTDが２つのリンカーを利用して，tRNAをSepRSからSepCysSへ移動させるという作業仮説を立てることができた．今後は，その仮説を検証するために様々な変異体を作製し，活性測定とtRNA結合実験を行い，その結果をもとに論文を作製して発表する．
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Research Products
(2 results)
