2015 Fiscal Year Annual Research Report
固体NMRによる光受容蛋白質ロドプシンのレチナール結合部位の精密構造解析法の開発
| Project/Area Number |
15H04336
|
|---|
| Research Institution | Yokohama National University |
|---|
Principal Investigator |
川村 出 横浜国立大学, 工学(系)研究科(研究院), 准教授 (20452047)
|
|---|
| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
五東 弘昭 横浜国立大学, 工学(系)研究科(研究院), 准教授 (80635235)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
|
| Keywords | 固体NMR分光法 / レチナール / 13C安定同位体標識 / ロドプシン / 7回膜貫通型タンパク質 |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
光を利用して機能するロドプシンタンパク質の機能や吸収波長などを制御した分子設計を目指すにあたって、発色団レチナールが結合しているレチナール結合ポケットの動的構造の理解は極めて重要である。レチナールの13C NMR信号を基にした固体NMRによるレチナール結合部位の精密構造解析の研究を展開するため、本年度は高度好塩菌H. salinarumの紫膜に発現したバクテリオロドプシンから安定同位体標識レチナールの抽出・精製を試みた。有機溶媒を用いた標準的な方法によって紫膜からレチナールを抽出し、LC-MSによる分析でFractionのひとつに部分的に13Cが導入されたレチナールを確認した。今後、大腸菌発現系で利用していくに当たって、LC-MSの分画の分解能や標識率の算出などの問題点が出てきた。
一方、微生物型ロドプシンを対象として、そのレチナール結合部位に高く保存されているTyr、AspやLysなどのNMR信号を選択的に観測する実験を行い、レチナール近傍のアミノ酸残基との相互作用を高い分解能で測定することに成功した。13C複数標識レチナールを用いた固体NMR構造解析の基礎条件の検討は十分に進めることができた。
さらに先の段階で使用することになるIn-situ光照射-固体NMR法によって、バクテリオロドプシンY185F変異体の光中間体の観測やセンサリーロドプシンIIのシッフ塩基のプロトン化・脱プロトン化を反映する15N Lysの光誘起信号変化の観測にも成功した。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
紫膜からのフラクションの分離がやや低い分解能であることと、MSによる解析から安定同位体標識の割合にやや分布があり、高い同位体標識率のレチナールが得られていない。一方で固体NMRを用いた部位特異的標識レチナールを用いた実験では、十分にレチナール結合ポケットのアミノ酸残基の信号が観測できているため、次の展開である複数の炭素がラベルされたレチナールを用いて、双極子相互作用の強さの計測によってレチナールのねじれと周辺アミノ酸残基との相互作用の相関などの測定準備はできている。
|
| Strategy for Future Research Activity |
培地の炭素源を変更するなど培養条件の改良および工業生産されているベータカロチンを酵素で切断処理することで生成する方法を試み、標識レチナールの合成を行う。
引き続き、固体NMR測定に関しては新たな手法を取り入れ、実施していく。
|
