2015 Fiscal Year Annual Research Report
立体構造情報を活用した上皮細胞の接着と細胞形態の動的制御機構の解明
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15H04337
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| Research Institution | Nagoya University |
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Principal Investigator |
廣明 秀一 名古屋大学, 創薬科学研究科, 教授 (10336589)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | タイトジャンクション / PDZドメイン / タンパク質間相互作用阻害剤 / 中分子創薬 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本申請研究は、タイトジャンクション動的平衡仮説にもとづき、TJの裏打ちタンパク質PDZドメインを標的とした創薬研究である。申請者は、更に他の経路のPDZドメインタンパク質に作用し、上皮細胞の形態を大きく変える化合物も同定した。それらの作用機序を分子的に解明することで、TJ制御薬や、制がん剤となるWntシグナル阻害剤などの薬効を更に増し、副作用を未然に回避するための技術基盤が構築できると考える。そこで、TJ制御ならびにアクチン細胞骨格制御、Wntシグナル伝達系などで働く制御蛋白質に含まれる9種のPDZドメインに対して、[化合物] ：[9種のPDZドメインとの物理化学的相互作用] ： [培養細胞レベルでのフェノタイプ]の複合的・統合的な構造活性相関の研究を行うこととした。平成28年度は、以下の研究を行った。
１．未整備のPDZドメインのタンパク質発現系（LARG, LIM-K1, LIM-K2）について、発現系を構築した。また既に構築していたDVL1-PDZ、DVL2-PDZについて発現系を最適化した。
２．LIM-K1-PDZドメイン単体でのNMRシグナル帰属を試みたが試料の性質が悪く断念した。
３．Afadin, DVL1, DVL2のPDZドメインに対するドッキング（バーチャルスクリーニング）を行った。DVL1-PDZについてはNMR解析も進めた。
４．既に所有している19種の化合物の細胞接着・バリア機能に関する細胞アッセイを進めた。二種類のサブタイプのMDCK細胞の他にCaco2細胞、Eph4細胞における経皮内電気抵抗（TEER）測定を行い、薬物の応答を確認した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
4: Progress in research has been delayed.
Reason
１．平成２７年度は、特にLIM-K1およびLIM-K2のPDZドメインに注力して、そのNMR解析を完了し、立体構造解析まで進める予定であった。しかし、特にLIM-K1-PDZドメインのタンパク質としての性質が悪く、大腸菌での十分な発現量、ならびに、濃縮した際の単分散のタンパク質試料の特徴である、アミドシグナルの分離のよいNMRスペクトルが得られなかった。その対策として、構築した発現系のタンパク質の領域を精査し、発現系の作り直しを行った。同様の作業をDVL1-PDZに対しても行った。その結果、ヒトLIM-K2-PDZドメインについては、一定の改善を見たので、マウスLIM-K2-PDZドメインの既報の結果を参考にしつつ研究を進めることとした。結果的にLIM-K1-PDZの解析については断念せざるを得なかった。
２．Afadin, DVL1, DVL2のPDZドメインに対するドッキング（バーチャルスクリーニング）を行った。DVL1のPDZドメインについては、既に保有していた試料に比べて著しい性質の改善が見られ、NMRスペクトルの感度も向上した。そこで、DVL1-PDZについては3次元NMRの測定を進め、シグナル帰属の解析も進めた。
３．既に所有している19種の化合物の細胞接着・バリア機能に関する細胞アッセイを進めた。二種類のサブタイプのMDCK細胞の他にCaco2細胞、Eph4細胞、における経皮内電気抵抗（TEER）測定を行った。Caco2細胞は、既報の通り、ディッシュ上で安定した単層細胞シートを形成し、TJが形成し成熟するまで10日以上の日数がかかることがわかった。CLD2以外のCLDやOCLNについて、それぞれの細胞でのTJへの集積の様子を蛍光顕微鏡観察によって追跡し、TJ制御薬剤による変動の観察にも成功した。
これらを総合し、特に１の計画の一部の断念を重く見て、遅れているとした。
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| Strategy for Future Research Activity |
上記項目１の遅れを取り戻すべく、LIM-K2-PDZのNMR解析を進める。また、改質したDVL1-PDZのスペクトルの質がかなりよいので、DVL1-PDZのNMR解析ならびにDVLを標的としたインシリコスクリーニングを精力的に行う。バーチャルスクリーニングに関しては、複数のドッキングアルゴリズムを比較する以前に、研究代表者がこれまで使い込んできたGOLDの、複数（最大で16種類）のスコアリング関数について、実験データによるフィードバックをかけながら、最適化し、その最適化の結果をもって、新たに新規化合物をスクリーニングするというアイデアの着想に到った。そこで、NMR滴定実験の結果と、複数のバーチャルスクリーニングの結果の整合性を評価するための統計的手法など、来年度は、NMR実験とインシリコによる研究を同時に実施できる、当研究室の強みを活かした研究を推進することとする。
併せて、TJ動的平衡の細胞生物学的全体像を解明する基礎データとして、MDCK細胞、Caco2細胞、Eph4細胞のTJ形成過程の観察（とTJ制御剤を添加したときの変化の観察）を続ける。
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[Journal Article] Crystal structure of afadin PDZ domain-nectin-3 complex shows the structural plasticity of the extended ligand-binding site.2015
Author(s)
7.Fujiwara Y, Goda N, Tamashiro T, Narita H, Satomura K, Tenno T, Nakagawa A, Oda M, Suzuki M, Sakisaka T, Takai Y, Hiroaki H.
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Journal Title
Protein Sci.
Volume: 24
Pages: 376-385
DOI
Peer Reviewed
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