2016 Fiscal Year Annual Research Report
G蛋白質非依存的な情報伝達を行い、抗癌剤の標的であるケモカイン受容体の構造解析
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15H04338
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
島村 達郎 京都大学, 医学研究科, 特定講師 (90391979)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 結晶構造解析 / G蛋白質共役型受容体 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
新規の抗がん剤の標的としても注目されているケモカイン受容体７は、GPCRの一種だが、Gタンパク質とは共役せず、βアレスチンとだけ共役するという特徴を持つ。本研究ではケモカイン受容体７の立体構造を解明し、GPCRのβアレスチンを介す情報伝達経路の詳細な理解や、新規抗がん剤の合理的な開発などに役立てることを目標としている。GPCRを結晶化するにはループ領域を他の親水性タンパク質で置換したり、点変異を導入することにより安定化させる必要がある。親水性タンパク質としては、これまでにT４リゾチーム、cytochrome b562RIL、rubredoxinなど他のGPCRの安定化に利用されたもののほか、幾つかのGPCRを安定化しそうなタンパク質を試した。また、これらの挿入部位もN末端や細胞内第３ループなどを検討した。これまでのところ細胞内第３ループにcytochrome b562RILを挿入したコンストラクトが最も良い単分散性を示した。また、数１０箇所の点変異導入も検討し、いくつかのものでは安定性が向上していた。このようなスクリーニングを効率的に行うために、新たなスクリーニング方法も開発した。成績の良かったコンストラクトは昆虫細胞もしくは酵母で大量発現し結晶化を試みた。リガンドは、低分子化合物のほか、環状ペプチドも試した。現在までに結晶化には成功していない。。GPCRの結晶は微結晶であることが多く、本研究ではX線自由電子レーザーを用いたシリアルフェムト秒結晶構造解析を行う可能性も考えられた。そこでX線自由電子レーザーを利用するための測定系の開発にも取り組み、データ取得のための基盤を確立できた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
X線自由電子レーザーを利用するための測定系の基盤は想定より早く確立できた。ケモカイン受容体７の結晶化には成功していないが、受容体の結晶化には通常は３年以上は必要である。
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| Strategy for Future Research Activity |
現状のコンストラクトで水溶性蛋白質の接続部位の検討や複数の点変異の組み合わせなどにより更に安定性を向上させ、結晶化を成功させる。また、これまでに試した低分子量リガンド、環状ペプチドの親和性が不十分である可能性を考え、ケモカインの生産型を確立し、ケモカインとの複合体の結晶化も試みる。
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[Journal Article] A three-dimensional movie of structural changes in bacteriorhodopsin.2016
Author(s)
Nango E, Royant A, Kubo M, Nakane T, Wickstrand C, Kimura T, Tanaka T, Song C, Tanaka R, Arima T, Yamashita A, Kobayashi J, Hosaka T, Sugahara M, Nam D, Nomura T, Shimamura T, Im D, Fujiwara T, Yamanaka Y, et al.
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Journal Title
Science
Volume: 354
Pages: 1552-1557
DOI
Peer Reviewed / Int'l Joint Research
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[Journal Article] Membrane protein structure determination by SAD, SIR, or SIRAS phasing in serial femtosecond crystallography using an iododetergent.2016
Author(s)
Nakane T, Hanashima S, Suzuki M, Saiki H, Hayashi T, Kakinouchi K, Sugiyama S, Kawatake S, Matsuoka S, Matsumori N, Nango E, Kobayashi J, Shimamura T, Kimura K, Mori C, Kunishima N, Sugahara M, Takakyu Y, Inoue S, Masuda T, et al.
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Journal Title
Proc Natl Acad Sci U S A.
Volume: 113
Pages: 13039-13044
DOI
Peer Reviewed
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